5-羟甲基糠醛与氨基酸反应形成的风味物质

王 歌 曾 睿 邱瑞霞 黄才欢 郑 洁

(暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510000)

5-羟甲基糠醛又称羟甲基糠醛(HMF)，是一种呋喃类化合物。纯品是暗黄色液体或粉末，具有吸湿性，易液化。HMF具有活泼的α,β-不饱和羰基结构，化学性质非常活泼，可发生氧化还原、脂化、聚合、水解等多种反应。HMF普遍存在于热加工食品中，它以己糖为前体物质，主要通过美拉德反应和焦糖化反应产生[1]。此外还可通过2条途径产生HMF：① 葡萄糖、蔗糖、果糖等在高温下直接裂解产生，其中果糖呋喃阳离子是HMF重要的前体物质；② 二羰基化合物如丙酮醛和甘油醛等发生羟醛缩合产生HMF[2]。由于HMF在动物和人体内可能转化为致癌物质羟甲基糠酸磺酸盐，所以HMF被认为是一种食品内源污染物。HMF含有羰基，可与氨基发生美拉德反应，Gokmen等[3]、Zhao等[4]都研究证明HMF与氨基酸可发生美拉德反应。美拉德反应是食品风味的主要贡献者，HMF是美拉德反应中的中间产物，所以推测HMF与氨基酸可能会产生风味物质，但目前有关食品中HMF的研究主要集中在HMF的危害及控制等方面[5]，缺少HMF对风味物质影响的研究。

本研究拟将氨基酸与HMF反应，利用顶空固相微萃取法提取并用GC-MS鉴定反应体系中的挥发性成分，以此研究HMF对食品风味的贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-丙氨酸(Ala)、γ-氨基丁酸(Gaba)、5-羟甲基糠醛(HMF)：分析纯，百灵威科技有限公司；

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：分析纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

气质联用仪：7890/5975型，美国安捷伦公司；

毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：DB-1MS型，美国安捷伦公司；

SPME萃取头：75 μm CAR/PDMS型，美国Supelco公司；

旋转蒸发仪：EYELA型，上海爱朗仪器有限公司；

集热式磁力加热搅拌器：DF-101S型，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 HMF与氨基酸反应体系的建立 根据杨忠全等[6-8]的方法，修改如下：将L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、γ-氨基丁酸和HMF分别用pH 7的磷酸缓冲液(PBS)溶解，配成含氨基酸250 mmol/L，HMF 2.5 mmol/L的混合液4 mL，置于20 mL的不锈钢管中。旋紧不锈钢管盖(带有聚四氟乙烯垫片)，放置于带有磁力搅拌装置的油浴锅中(搅拌速度为300 r/min)， 在160 ℃下反应15 min，反应结束后将试管迅速放入冰水浴中冷却。

1.3.2 反应物浓度与反应时间对特征风味物质产生的影响

设置2个不同浓度HMF和氨基酸的反应体系，分别是：HMF 2.5 mmol/L+氨基酸250 mmol/L；HMF 5.0 mmol/L+氨基酸500 mmol/L。在160 ℃下分别反应8，15 min，研究反应物浓度和反应时间对风味物质形成的影响。

1.3.3 反应体系的pH值和褐变的测定 用pH计测定反应前后体系的pH变化；用紫外分光光度计，在420 nm下测定反应体系的吸光度(OD值)以判断褐变程度。

1.3.4 挥发性物质的提取与测定 将反应物用PBS定容到5 mL，加入1 g氯化钠，置于15 mL的顶空固相微萃取玻璃瓶中[9-10]，用带有尼龙材质垫片的瓶盖将玻璃瓶迅速密封。将玻璃瓶置于带有磁力搅拌的恒温水浴锅中，80 ℃下平衡60 min，然后迅速将顶空固相微萃取CAR/PDMS 萃取头插入密封的小瓶中，并将萃取头的纤维悬在样品的顶空并保持 30 min[11-12]。萃取后将萃取头立即插入气质联用仪的进样口，在250 ℃下维持15 min，释放被吸附的挥发性物质。GC-MS分析条件：电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描时间3.89 s，氦气流速0.8 mL/min，质谱扫描范围30～400。柱温箱的升温步骤为：初始温度45 ℃，保持5 min，以6 ℃/min 升温到 90 ℃，以 10 ℃/min 升温到 220 ℃，维持10 min。通过NIST08.L 谱库检索比对结果，对物质进行定性，选择匹配度80%以上的物质分析，利用峰面积比较物质的相对含量。

1.3.5 数据处理与分析 利用SPSS 13.0软件处理GC峰面积数据，用平均值和标准偏差表示结果。使用 Duncan 检验分析显著性，显著性水平为P=0.05，每个试验平行测定3次。

2 结果与分析

2.1 反应前后体系的pH与褐变程度的变化

由表1可知，在4个HMF-氨基酸反应体系中，反应后pH都略有降低，但没有显著性差异(P>0.05)。与文献[13]的结论一致。4种氨基酸与HMF发生反应前均没有吸光度值，发生反应后都产生了不同程度的褐变(OD420值)，与反应前相比具有显著性差异(P<0.05)，说明HMF与氨基酸发生了美拉德反应，但不同HMF-氨基酸体系间无显著性差异(P>0.05)。

表1 HMF-氨基酸体系pH与褐变程度的变化†Table 1 Changes in pH and browning in HMF-Amino acid reaction systems

† 不同字母代表不同体系间差异显著(P<0.05)。

2.2 HMF对美拉德挥发性成分的影响

将HMF与4种氨基酸反应(2.5 mmol/L HMF+250 mmol/L 氨基酸，160 ℃，15 min)，结果与NIST08.L谱库比对，HMF-氨基酸反应体系中生成的挥发性物质见表2。在4个反应体系中共鉴定出挥发性成分21种，大多是羰基化合物，包括醛类8种、酮类3种、吡嗪类4种、烃类3种。烃类物质的芳香阈值较高，对食品的风味贡献不大；醛类和酮类具有绿色植物的香味，在很多美拉德反应中均有检出，对食品风味有贡献作用；吡嗪类物质是许多热加工食品中的重要挥发性成分，具有浓厚的肉香味，是一类特征性风味物质[14]。

在HMF-Ser体系中检测出5种挥发性物质，5-甲基-2-呋喃甲醛、壬醛、吡嗪是该体系的特征风味物质。在HMF-Thr体系中检测出10种挥发性物质，特征风味物质是苯乙酮、3-甲基-吡嗪与2,5-二甲基-吡嗪。在HMF-Gaba体系中检测出5种挥发性物质，特征风味物质是癸醛。在HMF-Ala体系中检测出7种挥发性物质，特征风味物质是壬醛、癸醛。

在4种氨基酸中，苏氨酸对风味贡献较大。HMF-Thr反应体系产生了3种吡嗪类化学物，其中2,5-二甲基-吡嗪、3-甲基-吡嗪的峰面积很大，是HMF-Ser体系产生的吡嗪峰面积的16倍。吡嗪是美拉德反应产生的主要挥发性物质，在非硫氨基酸参与体系中较多，在加热牛肉的渗出物中甚至达到50%[15]。吡嗪类物质具有坚果、烧烤等气味，是一种重要的呈香物质，对食品风味具有较大贡献[16-17]。此外，吡嗪类物质常用作医药、香精香料中间体[18]。HMF-Thr反应体系产生的苯乙酮具有香豆素和扁桃的气味，有甜香尖刺气息，苦芬芳的风味，在食品中常做香料，主要用于配制樱桃、葡萄等多种水果和烟草的香精，对食品风味具有积极的贡献[19]。HMF-Thr反应体系还产生了5种醛类物质，其中癸醛稀释时有甜橙和橘子香气，并带有油脂气息，壬醛具玫瑰、柑橘等香气和强的油脂香气。这些醛类物质是焙烤食品的特征性风味物质[20]，对食品风味均有积极贡献。

表2 HMF+氨基酸反应体系中的挥发性成分†Table 2 Volatile components produced in HMF-Amino acid reaction systems

† “—”表示未检出；不同字母代表不同体系间差异显著(P<0.05)。

HMF-Gaba体系和HMF-Ala体系相比于其他2种氨基酸体系，检测出的挥发性物质含量较低，可能与不同氨基酸的结构有关。虽然HMF-Ala体系检测出的挥发性物质含量较低，但产生了香叶基丙酮。香叶基丙酮具有清香，果香，并且有淡雅清新的玫瑰香味。在自然界中存在于茶叶、薄荷、茴香等物质中[21]，该物质广泛用于香精香料等工业。

2.3 反应物浓度与反应时间对特征性风味物质产生的影响

图1是HMF-氨基酸体系在不同反应物浓度和不同反应时间下的特征性风味物质的峰面积柱状图。在HMF-Ser体系中反应物浓度对风味物质形成量影响很大。由图1(a)可看出，在不同反应时间(8，15 min)下，高浓度(5 mmol/L HMF+500 mmol/L Ser)体系的吡嗪和5-甲基-2-呋喃甲醛生成量均显著高于低浓度体系的。但是壬醛只有在长时间(15 min)反应条件下生成量才随浓度增大而增高。此外，试验还发现反应时间对这3种特征风味物质的影响只在高浓度体系下较显著，在低浓度体系中，不同反应时间下它们的生成量没有显著性差异。反应15 min时，高浓度体系中吡嗪、5-甲基-2-呋喃甲醛和癸醛的含量分别是低浓度体系的100，10，5倍。说明在HMF-Ser体系中吡嗪、5-甲基-2-呋喃甲醛和壬醛的产生对氨基酸、HMF浓度以及加工时间均有要求。图1(b)是HMF-Thr体系在不同反应物浓度和不同反应时间下的特征性风味物质的峰面积柱状图。由图1(b)可以得出，在2个底物浓度下，反应15 min比反应8 min产生的苯乙酮、3-甲基-吡嗪、2,5-二甲基-吡嗪的量均显著增多。而反应物浓度的变化对3种特征性风味物质的影响较小，高浓度下产生的苯乙酮、3-甲基-吡嗪、2,5-二甲基-吡嗪含量仅是低浓度下的1.2～1.5倍。说明在HMF-Thr体系中反应时间是影响苯乙酮与3-甲基-吡嗪生成的唯一因素。在对富含苏氨酸的食品加工时，通过改变加热时间，可以调整食品的风味与口感。图1(c)是HMF-Gaba体系在不同反应物浓度和不同反应时间下的特征性风味物质的峰面积柱状图。由图1(c)可以看出，在相同反应物浓度下，癸醛的生成量随着反应时间的延长而增多。反应15 min时，癸醛的生成量随着浓度的增加而增多，而反应8 min时，浓度对于癸醛的生成量没有显著性影响。说明反应物浓度和反应时间对癸醛的生成量均有影响，但是反应物浓度要在长时间反应条件下才会有显著性影响。图1(d)是HMF-Ala体系在不同反应物浓度和不同反应时间下的特征性风味物质的峰面积柱状图。由图1(d)可知，壬醛、癸醛生成量随反应时间的延长而增多，但在相同反应时间下，壬醛、癸醛生成量随浓度增加而减少。通过与HMF-Ser体系、HMF-Gaba体系对比，3个体系中壬醛、癸醛的生成量呈现不同变化趋势。据此推测反应物浓度和反应时间对壬醛、癸醛生成量的影响可能与参与反应的氨基酸类型及结构关系密切。

不同字母表示不同反应体系间差异显著(P<0.05)；1为5 mmol/L HMF+500 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，8 min；2为5 mmol/L HMF+500 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，15 min；3为2.5 mmol/L HMF+250 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，8 min；4为2.5 mmol/L HMF+250 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，15 min

图1 反应物浓度与反应时间对HMF-氨基酸体系特征性风味物质产生的影响

图1 Effect of reactant concentration and reaction time on the production of flavors in HMF-Amino acid reaction systems

3 结论

HMF可与4种氨基酸发生美拉德反应产生挥发性物质，其中吡嗪、3-甲基-吡嗪、苯乙酮、壬醛、癸醛、香叶基丙酮等物质已被证明是美拉德反应体系产生的风味物质，对食品风味均有积极作用。同时，氨基酸与HMF的浓度和反应时间对各反应体系中特征性风味物质的生成量有较大影响。本研究用峰面积定量挥发性物质，后续的研究可以采用内标法处理，以便更精准地分析挥发性物质。