PKCβ抑制剂Ruboxistaurin对糖尿病大鼠不同脏器抗氧化物质的影响

罗 军,夏中元,张 元,苏娃婷,雷少青

(武汉大学人民医院麻醉科,武汉 430060;*通讯作者,E-mail:xiazhongyuan2005@aliyun.com)

生理状态下,机体内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的产生与消除处于动态平衡的稳定状态;而糖尿病状态下,持续高血糖刺激可诱导ROS蓄积,从而大量消耗抗氧化物质,引起氧化应激损伤[1]。虽然,ROS过剩的不良影响对所有细胞而言是一致的,但是临床上常见的糖尿病靶器官损害主要发生在:心脏、肾脏、外周神经、视网膜病等[2]。这提示,不同组织对糖尿病诱导的氧化损伤耐受性具有差异性。既往研究表明,丝氨酸/苏氨酸激酶PKCβ高度活化是糖尿病诱导的氧化损伤的重要机制[3];抑制PKCβ似乎是糖尿病及其并发症防治的有效途径[4]。然而,现有的研究结论并不一致;因此,本研究拟通过构建1型糖尿病模型,并应用PKCβ抑制剂RBX干预,以探究RBX对糖尿病大鼠不同脏器抗氧化物质的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

30只8周龄SPF级雄性SD大鼠,体质量220-250 g,按随机数字表法分为3组:正常对照组(C组,n=6)、糖尿病组(DM组,n=12)和糖尿病+RBX治疗组(DM+RBX组,n=12)。所有动物购自湖北省疾控中心,饲养于武汉大学动物实验服务中心,商品化标准饲料和饮水供实验动物自由摄取。

1.2 糖尿病模型构建

建模前,适应性喂养3 d,禁食过夜,戊巴比妥65 mg/kg妥善麻醉。采用一次性尾静脉注射链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司)65 mg/kg诱导糖尿病模型;正常对照组注射同体积STZ配制液。给药72 h,尾静脉采血,血糖仪(德国Bayer公司)检测各大鼠血糖水平,以超过16.8 mmol/L为糖尿病模型成功标准。本次实验中,DM组有1只大鼠血糖值未达到成模标准,予以剔除。DM+RBX组大鼠每天灌胃给予RBX(瑞士Alexis公司)1 mg/kg,其余两组给予等体积生理盐水。每周监测血糖、血甘油三酯水平,每天记录大鼠食物、饮水消耗量,以及垫料干湿重。两天更换一次垫料,并计算垫料干湿重比值。其计算公式为:垫料干湿重比=1-(垫料湿重-垫料干重)/垫料湿重×100%。垫料干湿重比值与大鼠排尿量成负相关关系。

1.3 指标检测

糖尿病成模满4周后,处死大鼠,获取血浆,心、肺、肝、肾组织总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。采用商品化试剂盒分别检测血甘油三酯含量、总抗氧化能力(以总抗氧化物含量表示),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及过氧化氢酶(catlase,CAT)活性。所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,并严格按说明书操作。

1.4 统计分析

采用Graph Pad Prism 7.04软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用Tukey’s检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况的比较

与Con组比较,DM组及DM+RBX组大鼠饮水量、进食量、血糖及血甘油三酯含量显著升高(P<0.05),而垫料干湿比、体质量显著降低(P<0.05,见图1)。与DM组比较,DM+RBX组大鼠食物消耗量、血糖及血甘油三酯含量显著降低(P<0.05),垫料干湿比显著升高(P<0.05),而饮水量及体质量无明显变化(P>0.05,见图1)。

与Con组比较,*P<0.05;与DM组比较,#P<0.05图1 各组大鼠一般情况的比较Figure 1 Comparison of the general characteristics of rats among three groups

2.2 各组大鼠各组织总抗氧化物含量的比较

与Con组比较,DM组大鼠心组织总抗氧化物含量显著增加(P<0.05),而肺、肝、肾组织总抗氧化物含量显著减少(P<0.05,见图2);DM+RBX组大鼠心组织总抗氧化物含量显著增加(P<0.05),肺、肝组织总抗氧化物含量显著减少(P<0.05),而肾组织总抗氧化物含量无明显变化(P>0.05)。与DM组比较,DM+RBX组大鼠心、肾组织总抗氧化物含量显著增加(P<0.05),而肺、肝组织总抗氧化物含量无明显变化(P>0.05,见图2)。

2.3 各组大鼠各组织SOD活性的比较

与Con组比较,DM组大鼠心肌组织SOD活性显著增加(P<0.05),而肺、肝、肾组织SOD活性显著降低(P<0.05,见图3);DM+RBX组大鼠肺、肝组织SOD活性显著降低(P<0.05),但心、肾组织SOD活性无明显变化(P>0.05)。与DM组比较,DM+RBX组大鼠心肌组织SOD活性显著降低(P<0.05),肾组织SOD活性显著增加(P<0.05),而肺、肝组织SOD活性无明显变化(P>0.05,见图3)。

与Con组比较,*P<0.05;与DM组比较,#P<0.05图2 各组大鼠各组织总抗氧化物含量的比较Figure 2 Comparison of total antioxidant concentration in different tissues among three groups

与Con组比较,*P<0.05;与DM组比较,#P<0.05图3 各组大鼠各组织SOD活性的比较Figure 3 Comparison of SOD activity in different tissues among three groups

2.4 各组大鼠各组织CAT活性的比较

与Con组比较,DM组大鼠心、肝、肾组织CAT活性显著增加(P<0.05),而肺组织CAT活性无明显变化(P>0.05,见图4);DM+RBX组大鼠肺组织CAT含量显著减少(P<0.05),肾组织CAT活性显著增加(P<0.05),而心、肝组织CAT活性无明显变化(P>0.05)。与DM组比较,DM+RBX组大鼠心、肺、肝组织CAT活性显著减少(P<0.05),而肾组织CAT活性无明显变化(P>0.05,见图4)。

与Con组比较,*P<0.05;与DM组比较,#P<0.05图4 各组大鼠各组织CAT活性的比较Figure 4 Comparison of CAT activity in different tissues among three groups

3 讨论

随着全球糖尿病人群数量的不断增加,使得糖尿病并发症的发病率和死亡率不断升高。目前临床上常见的糖尿病并发症主要包括:糖尿病心脏病、糖尿病肾病、糖尿病外周神经病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病足等[5]。虽然,其他糖尿病相关的靶器官损害并不常见,但已有研究提出“糖尿病肺[6]”、“非酒精性脂肪肝[7]”、“糖尿病认知功能损害[8]”等概念。因此,关注糖尿病的多脏器损害,具有重要意义。

生理状态下,细胞生命活动产生的ROS可及时有效地被抗氧化系统清除,以维持细胞内氧化还原稳态。细胞内ROS的清除主要通过抗氧化酶(如SOD、CAT、辅酶Q10等)和非酶(如维生素C、Zn、Mn等)两大途径。在糖尿病状态下,慢性或间歇性高血糖刺激可诱导ROS蓄积,进而大量消耗抗氧化物质,造成氧化应激损伤[2,5]。然而,外源性补充维生素E、维生素C等抗氧化剂并未能改善糖尿病及其并发症的进展[5]。因此,仍需进一步探究糖尿病靶器官氧化损伤的具体机制。

既往研究指出,PKCβ活化与糖尿病及其并发症的发生发展密切相关[3]。在人肾小球系膜细胞中,高糖环境可诱导PKCβ高表达,并导致ROS蓄积[9]。此外,PKCβ可激活胆固醇调节元件结合蛋白1C,进而促进肝细胞脂肪生成,导致胰岛素抵抗和脂质过氧化损伤[10]。而应用PKCβ抑制剂RBX干预,可有效抑制糖尿病大鼠心肌组织PKCβ2(PKCβ亚型)活化,减心肌氧化损伤,改善左心室舒张功能[11]。使用siRNA或RBX下调PKCβ表达,亦可改善糖尿病肾组织氧化损伤[3]。本研究亦发现,RBX治疗可显著增加心、肾组织总抗氧化物含量,具有类似抗氧化的作用。因此,PKCβ过度活化可能是糖尿病靶器官氧化损伤的重要机制。

早期积极控制血糖是临床上糖尿病及其并发症治疗的基础[12]。在本研究中,糖尿病大鼠表现出了多饮、多食、多尿、体质量减轻,以及高血糖、高甘油三酯等1型糖尿病的典型特征;而PKCβ特异性抑制剂RBX,可有效降低糖尿病大鼠血糖水平,一定程度上改善其症状。虽然,RBX制剂已经被FDA批准用于临床上糖尿病视网膜病变和糖尿病黄斑水肿的防治;但一项有关糖尿病外周神经病变的3期临床试验中,RBX并未显示出预期的保护作用[4]。可见,糖尿病状态下,RBX的疗效具有组织特异性。本研究亦发现,RBX可不同程度增强组织总抗氧化能力,但心、肾组织对RBX的治疗反应性较好。因此,进一步探究RBX在糖尿病状态下的多脏器作用,将为临床上糖尿病药物研发提供新思路。