灵芝功能性食品对小鼠免疫功能促进作用的研究

林花 王霞 车成来 王欣宇 王宇辉 金龙哲

（延边州农业科学院，吉林 延吉133000）

灵芝Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.)Karst. 为多孔菌科真菌灵芝的干燥子实体，《神农本草经》记载灵芝具有“益心气”、“补肝益气”、“安心神”的作用[1]，灵芝功能性食品是以灵芝多糖和破壁灵芝孢子粉为主要原料，按一定比例配制而成的产品。

现代研究表明，灵芝孢子粉和灵芝多糖能增强人体的免疫功能[2]，其中灵芝孢子对现代常见的疾病如心脑血管疾病、糖尿病或哮喘等均有一定的疗效[3-5]，灵芝孢子亦有研究表明具有抗疲劳、调节内分泌和抗衰老等作用[6]，而破壁后的灵芝孢子粉中的有效成分更易被人体内摄取吸收。灵芝多糖[7]是灵芝中最有效的成分之一，研究具有降血糖[8-9]、降血脂[10-11]、抗肿瘤[12-14]等作用。本品两者配伍，其具有更好的增强免疫力功效。本研究通过脏器指数测定，ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，迟发型变态反应，血清溶血素测定，抗体生成细胞检测，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞、小鼠碳廓清、NK细胞活性测定等试验，研究探讨灵芝功能性食品对小鼠免疫力作用，以期了解灵芝功能性食品对小鼠是否具有免疫调节作用，旨在为灵芝系列产品的研制加工及进一步开发提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

灵芝功能性食品；选用体重18～22g的雄性Balb/c小鼠（SPF级）。

1.2 剂量选择

将已购回的动物饲喂基础饲料，逐步适应后，随机分组为0.33、0.67和1.00 g/kg·bw组（分别相当于送检方推荐的人体每日服用建议剂量的10倍、20倍和30倍）及对照组。称取送检样品5g，加入少量灭菌去离子水，待充分碾磨后，加灭菌去离子水定容至100L，充分混匀，作为实验组高剂量组灌胃液；将灭菌水与高剂量组按照1/2的比例混匀后灌胃即为中剂量组灌胃液；用同样的方法，灭菌水对倍稀释中剂量组灌胃液，即为低剂量组灌胃液，该组为实验组。对照组则以灭菌水灌胃。1次/d灌胃量为20mL/kg.bw，连续灌胃30d灌以相应的剂量。

1.3 免疫指标实验

1.3.1 脏器/体重比值测定

连续灌胃30d，称取体重，处死小鼠，取出脾脏、胸腺，分别称量其各脏器的重量，并计算各脏器/体重比值（以mg/10g表示）。

1.3.2 迟发型变态反应(足跖增厚法)

在连续给药的第25天时，对每只小鼠进行腹腔注射 0.2mL的2%SRBC免疫，再灌胃4d，测致敏后4d，测左右足跖厚度3次，取平均值；在左右足跖部位皮下注射20%（v/v）SRBC，每只20μL。在注射24h后，测量该部位厚度3次，取平均值。计算攻击期间足跖厚度的差值，差值代表小鼠足跖增厚的程度。比较受试药物组的差值与对照组的差值，若显著高于对照组，则确定为阳性结果。

1.3.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）

灌胃30d后处死小鼠，在无菌状态下取出脾脏并撕碎，过200目筛网，用Hank’s液洗3次，用1640培养液配制细胞悬液3×106 个/mL。将每组脾细胞悬液放入每孔1mL的24孔板中，每组2孔，一孔作为对照组，加7550μL/孔ConA液（相当于7.5μg/mL），置CO2培养箱中培养，待培养68h后吸取0.7mL上清液，加入吸取相同量的1640培养液（不含小牛血清）和50μL的5mg/mL MTT液，培养4h。取出培养板，加入1mL酸性异丙醇，使紫色结晶完全溶解。待溶解后，将其移入比色杯中，在570nm波长处测定OD值，淋巴细胞的增值能力为加ConA孔OD值的均值减去未加ConA孔OD值的均值，比较受试样品组的光密度差值与对照组的光密度值，若显著高于对照组，则确定实验结果呈阳性。

1.3.4 血清溶血素测定（血凝法）

于给药25d后，每只动物腹腔注射0.2mL 2%的SRBC 免疫，再灌胃5d，眼球取血，离心10min，将取得的上清液每份稀释12孔，稀释不同浓度的血清，每孔100μL，再加入100μL 0.5%的SRBC悬液，混匀，37℃条件下观察湿盒的结果，3h后记录每个孔的凝集程度。计算抗体积数。比较受试样品组的抗体积数与对照组的抗体积数，若显著高于对照组，则判定为阳性结果。

1.3.5 抗体生成细胞检测

在连续给药25d后，对动物腹腔注射0.2mL 2%的SRBC进行免疫，再灌胃5d，处死小鼠，取其脾脏，匀碎过筛，用Hank’s液洁净3次，用完全1640培养液配至5×106 个/mL的细胞悬液，备用。将50μL 10%SRBC及20μL已配好的脾细胞悬液加入0.5mL（45～50℃）表层培养基中，快速搅拌，置于挂膜玻片使其凝固，将玻片扣放在片架上，置CO2培养箱培养1.5h放于玻片架凹槽内，并加入用SA缓冲液稀释的补体，培养1.5h后，以空斑数/106脾细胞表示，计数溶血抗体生成细胞数，比较受试样品组的空斑数与对照组的空斑数，若显著高于对照组，则判定为阳性结果。

1.3.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

给药30d后，每只动物进行腹腔注射1mL 20%的鸡红细胞悬液，待30min后将其颈部处死，固定在鼠板上进行解剖，向腹腔注射2mL生理盐水，并在小鼠体内混匀，从腹腔内吸出1mL洗液，放置于37℃湿盒内，待30min后取出，经漂洗、晾干、固定，加入4%GiemsaPBS液染色3min，漂洗、晾干，镜检计数。计算吞噬百分率及吞噬指数。比较受试药物组与对照组的吞噬百分率或吞噬指数，若相比有显著性差异，可确定为阳性结果。

1.3.7 小鼠碳廓清实验

灌胃30d后，将0.01ml/g·bw 1：4稀释的墨汁注入小鼠尾静脉，立即计时，于注入2min、10min时，取血收集20μL动物内眦静脉丛，放入含2mL 0.1%Na2CO3溶液的试管中，混匀，用7200分光光度计，测定OD值，其中0.1%Na2CO3溶液作为对照组实验进行测定。处死小鼠，取其体内肝脏和脾脏，吸净血污，称重并计数吞噬指数a。比较受试药物组的吞噬指数a与对照组的吞噬指数a，显著高于对照组，若则判定为阳性结果。

1.3.8 NK细胞活性测定

小鼠灌胃后，将其颈部处死取出脾脏，用Hank’s液洗液洗涤3次，用完全1640培养液分别配制细胞悬液2×107 个/mL。取300μL动物的细胞悬液，放于96孔板中，每孔加100μL靶细胞4×105 个/mL（YAC-1细胞），分别取100μL的靶细胞和培养液，作为靶细胞自然释放孔，同时取100μL的靶细胞和1%NP-40，作为最大释放孔，各3孔，37℃置于5% CO2培养箱中培养4h，取出离心5min。向各孔取100μL上清液，加入100μL基质液，置于另一培养板中，10min后加30μL 1mol/L HCl 直至反应终止，在分光光度计492nm处，测定OD值，并计算NK细胞活性率。比较受试动物组的NK细胞活性与对照组NK细胞活性，若其细胞活性显著高于对照组，则判定为阳性结果。

2 结果与讨论

2.1 样品对小鼠脏器/体重比值的影响

由表1可见，将不同剂量的灵芝功能性食品给予小鼠30d，采用统计学处理分析，小鼠脏器/体重比值在低、中、高剂量组与阴性对照组间比较均无显著性差异（P＞0.05），说明灵芝功能性食品对小鼠脏器/体重比值无影响。

表1 样品对动物脏器/体重比值的影响

2.2 样品对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响

抗原攻击后24h，比较低剂量组与对照组，足跖肿胀度未出现显著性差异（P＞0.05），中剂量组和高剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度有显著性差异（P＜0.05），如表2可见，中、高剂量的灵芝功能性食品能提高动物迟发型变态反应。

表2 样品对动物迟发型变态反应（DTH）的影响

2.3 样品ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）

经方差分析，灵芝功能性食品对小鼠进行各剂量组给药30d后，各剂量组与阴性对照组小鼠相比，显示其光密度差值无显著性差异（P＞0.05），说明灵芝功能性食品对ConA诱导动物淋巴细胞转化能力无影响。见表3。

表3 样品对小鼠淋巴细胞转化的影响

2.4 样品对小鼠血清溶血素产生的影响

将不同剂量的样品提取物给药小鼠30d，在低、中、高剂量组与阴性对照组进行组间比较，其抗体积数无显著性差异（P＞0.05），见表4。

表4 样品对小鼠抗体生成细胞数的影响

2.5 样品抗体生成细胞检测

对小鼠进行各剂量组给药30d后，高剂量组与对照组相比时发现，其抗体生成细胞无明显差异（P＞0.05），而低、中剂量组与对照组小鼠相比，其空斑数显著高于对照组的空斑数，其抗体生成细胞有显著性差异（P＜0.05），如表5。

表5 样品对小鼠抗体生成细胞的影响

2.6 样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

将小鼠灌以不同剂量的灵芝功能性食品30d，如表6，各剂量组与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数无显著性差异（P＞0.05）。

表6 样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

2.7 样品小鼠碳廓清实验

如表7所示，在给药小鼠30d期间，低剂量组和中剂量组与对照组小鼠相比，碳廓清吞噬指数a无明显差异（P＞0.05），高剂量组与对照组小鼠相比，碳廓清吞噬指数a有显著差异（P＜0.05）。

表7 样品对小鼠碳廓清的影响

2.8 样品对小鼠NK细胞活性的影响

如表8，不同剂量组药物对小鼠进行给药，其NK细胞活性中各组剂量组与对照组比较，NK细胞活性率无明显差异（P＞0.05），药物可增强小鼠的NK细胞活性。

表8 样品对小鼠NK细胞活性的影响

3 结论与讨论

灵芝多糖可有效提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞、淋巴细胞增殖能力以及体内网状内皮系统的功能[15]，实验表明，对于提高小鼠免疫功能的作用方面，破壁后的灵芝孢子粉要明显高于破壁前[16]。灵芝功能性食品是由灵芝多糖粉、破壁灵芝孢子粉经科学配置而成，两者均具有增强机体特异性与非特异性细胞免疫功能，对体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫功能均具有一定的作用。对Balb/c小鼠分别进行灌胃给予灵芝功能性食品低、中、高3种不同剂量的样品30d后，未见本品对小鼠体重和增重有不良影响。在小鼠脏器/体重比值测定中，各剂量组与对照组小鼠相比，其脏器/体重比值无明显差异（P＞0.05）。在迟发型变态反应实验中，中、高剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度有明显差异（P＜0.05），研究表明上述实验结果与给药剂量有关。在小鼠抗体生成细胞检测实验中，低、中剂量组与对照组小鼠相比，其抗体生成细胞有显著性差异（P＜0.05），说明低剂量组和中剂量组呈阳性结果，而高剂量组的灵芝功能性食品对小鼠无影响。在碳廓清实验中，高剂量组的碳廓清吞噬指数a明显高于对照组，具有显著性差异（P＜0.05），表明灵芝功能性食品具有提高非特异性免疫功能的作用。灵芝功能性食品有增强动物腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、有激活免疫细胞NK细胞活性的能力，实验证明灵芝功能性食品对细胞免疫功能有促进作用。根据评价标准表明灵芝功能性食品具有增强小鼠体内免疫力功能的作用。