姜黄素对博来霉素致大鼠急性肺损伤中肿瘤坏死因子-α和细胞间黏附分子-1表达的影响

胡亚男 郭志刚 李银生△

(新乡医学院, 1 组织学与胚胎学教研室, 2 形态学实验室, 新乡 453000)

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)可发生于各年龄阶段的人群,在临床上以起病急、发展迅猛、死亡率高为特点,早期如不有效控制病情将迅速发展成急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),重症患者更会演变为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[1]。多年的临床观察和实验研究表明,急性肺损伤发生时,全身炎症反应综合征[2](systemic inflammatory response syndrome, SIRS)与代偿性抗炎介质反应综合征(compensated anti-inflammatory response syndrome, CIRS)的平衡会很容易被打破,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)作为2种炎性介质也参与其中[3]。本研究探讨不同剂量姜黄素对急性肺损伤的保护作用,以及其作用机制是否与炎性介质TNF-α和ICAM-1相关,进而更好地为姜黄素的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

健康SD大鼠60只,SPF级,雄性,6周龄,体质量为140～150g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号： SCXK(京)2012-0001。注射用盐酸博莱霉素(日本化药株式会社,生产批号： 740140)。姜黄素(四川金郁金科技有限公司,生产批号： 080302,含量95.6%)。TNF-α试剂盒(BA1403)、ICAM-1试剂盒(BA2189)(博士德生物工程有限公司)。

1.2 模型建立及给药方法

60只大鼠随机分为假手术组,模型组,姜黄素高、中、低剂量组,每组12只。腹腔注射10%水合氯醛(每只3.0ml/kg),麻醉成功后将其固定在操作台上,消毒切皮逐层剥离暴露颈部气管,模型组和姜黄素高、中、低剂量组大鼠用注射器抽取0.3ml博来霉素生理盐水溶液(按5mg/kg比例溶于0.2～0.3ml生理盐水中),将注射器针尖对准环状软骨间隙刺入气管回抽见空气后,左手抬高动物头端一定角度,右手推动针头顺着气管后壁缓慢注射,再继续注入0.3ml空气,之后立即竖起动物左右旋转并轻拍大鼠胸背部促使药物在肺部均匀分布,假手术组用同样方法注入等体积生理盐水。造模24h后开始灌胃给药,姜黄素高、中、低剂量组给药剂量分别为200、100、50mg·kg-1·d-1[6],假手术组和模型组分别给予等体积生理盐水灌胃,实验期间大鼠均自由进食和饮水。

1.3 标本采集及观察指标

实验期间观察各组SD大鼠一般状况,分别在给药后的第3天和第7天各组随机放血处死6只,取大鼠右肺中叶3小块(约1cm×1cm×1cm)和2大块(约2cm×2cm×2cm),其中3小块经过生理盐水浸洗、裂解、离心、定量,之后遵照免疫印迹实验操作步骤执行,通过Image-Pro Plus 6.0软件分析所获取的目的条带(TNF-α、ICAM-1)与对应的内参照条带的积分吸光度值的比值;剩余2大块组织经固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片后,一部分用常规H-E染色观察其形态学改变,另一部分采用链霉亲和素-生物素复合物法对肺组织TNF-α和ICAM-1进行IHC染色,操作步骤严格遵循试剂盒说明书,之后通过使用高清晰度彩色医学图像分析软件HMIAS-2000对染色结果进行半定量分析,将肺组织各时点切片随机选取5个不重叠区域进行拍照(×400),输入图像分析软件测定免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度值(IOD值)。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般状况

假手术组大鼠摄食、饮水及活动均正常;模型组大鼠精神萎靡、毛发凌乱、不思饮食、活动性差,随时间延长,病情逐渐加重;姜黄素中剂量组大鼠随时间延长,精神、摄食、活动情况逐渐好转,高、低剂量组大鼠反应一直处于不适应状态,但比模型组状态好。

2.2 大鼠肺组织H-E染色

假手术组大鼠第3、7天肺组织结构未见异常;模型组大鼠第3天间质充血水肿、肺泡腔有炎性渗出,部分肺泡间隔增宽,第7天损伤明显加重,肺泡腔内炎细胞浸润增多,部分组织有增生表现;姜黄素高、中、低剂量组损伤肺组织都有不同程度减轻,炎细胞浸润减少,充血水肿程度减轻,其中以中剂量组效果最显著(图1)。

2.3 大鼠肺组织TNF-α及ICAM-1蛋白表达

经免疫组织化学法检测，各组中TNF-α蛋白均表达,模型组较假手术组显著升高(P<0.05),姜黄素低、高、中剂量组较模型组显著降低(P<0.05),且呈现逐渐下降趋势,中剂量组平均光密度值最低(表1,图2)。各组中ICAM-1蛋白表达趋势同TNF-α(表1,图3)。

经免疫印迹检测，各组中TNF-α蛋白、ICAM-1蛋白均表达,且急性肺损伤7d后表达更强,因此选取损伤后7d作为免疫印迹检测时间点,结果显示：模型组TNF-α较假手术组显著升高(P<0.05),姜黄素低、高、中剂量组较模型组显著降低(P<0.05),且呈现逐渐下降趋势,中剂量组平均光密度值最低(图4A,表2)。各组中ICAM-1蛋白表达趋势同TNF-α(图4B,表2)。

表1 大鼠肺组织中TNF-α、ICAM-1表达的免疫组织化学显色检测结果

*P<0.05vssham group,△P<0.05vsmodel group

图1 各组大鼠肺组织H-E染色,×400.图2 各组大鼠TNF-α免疫组织化学显色,×400.图3 各组大鼠ICAM-1免疫组织化学显色,×400.

图4 免疫印迹检法测第7天各组大鼠肺组织中TNF-α(A)和ICAM-1(B)的表达水平

表2 急性肺损伤7d后大鼠肺组织中TNF-α和ICAM-1的灰度值比

*P<0.05vssham group，#P<0.05vsmodel group

3 讨论

急性肺损伤是由重度感染、创伤和败血症等多种内外致病因素导致的以中性粒细胞浸润为主的严重肺内炎症反应[4],最终可发展成ARDS,病情危重且死亡率高[5]。TNF-α作为一种在炎症早期快速释放的快反应炎症因子，是介导肺组织内中性粒细胞参与肺损伤的分子生物学基础,在肺部被激活后则发生“呼吸大爆发”,消耗大量的氧并且产生过量的氧自由基,TNF-α和ICAM-1在急性肺损伤的发生发展中都起到非常重要的作用[6]。大量研究证明姜黄素具有抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化等功能[7],能够抑制前炎症介质发挥的抗炎作用[8],姜黄素不仅具有广谱的药理活性,而且毒副作用低,因此在临床上开发极具潜力[9]。

本研究结果表明,与姜黄素组大鼠相比,模型组大鼠的精神状态明显较差;H-E染色镜下显示肺组织结构破坏明显、肺泡腔内有大量炎症细胞浸润、肺间隔增宽;通过免疫组织化学和免疫印迹检测显示TNF-α、ICAM-1的表达量均明显增高,说明姜黄素确实在大鼠肺组织遭受外界刺激时起到了预防保护作用,其中以中剂量组抑制效果最好,差异有统计学意义。因此，应用姜黄素可在一定程度上减轻大鼠急性肺损伤时TNF-α、ICAM-1两种炎性因子的过度表达,进而减轻局部肺组织的炎症应激反应,为治疗和预防急性肺损伤提供了新的实验参考数据,但其明确的保护机制尚需进一步探索。