RNA干扰抑制肌腱细胞V型胶原表达对胶原纤维形成的影响

张国荣 李铁军

(1 长春中医药大学基础医学院组织学与胚胎学教研室, 长春 130117; 2 松原市长岭县卫生监督所, 松原 131500)

肌腱韧带损伤愈后常常由瘢痕组织替代,胶原纤维内的胶原原纤维直径明显变小,力学性能低下,易发生重复断裂[1-2]。肌腱内的胶原纤维主要由Ⅰ型胶原蛋白构成。Ⅴ型胶原蛋白含量很少,但在损伤肌腱中却持续高表达52周[3]。有研究显示,过多的Ⅴ型胶原抑制Ⅰ型胶原的生长自聚[4],所以降低Ⅴ型胶原表达可能有利于促进大直径胶原原纤维的再生,提高损伤肌腱的修复效果。本课题组前期培养的肌腱细胞中胶原原纤维直径减小,大小相对均一,与损伤肌腱类似[7]。RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)是一种高效、特异阻断靶mRNA表达而产生相应功能型缺失的新技术[5-6]。肌腱组织中Ⅴ型胶原的分子组成为COL5(α1)2(α2),本研究利用RNAi法干扰大鼠肌腱细胞中COL5α1和COL5α2基因表达,构建成组织工程肌腱进行胶原含量测定与微观形态检测,体外研究降低V型胶原表达对胶原纤维生长自聚的影响,从而探求V型胶原在肌腱损伤修复过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 肌腱细胞培养及组织工程肌腱的构建

取SD大鼠跟腱,按常规方法培养肌腱细胞,取P5以内的细胞用于后续实验。培养大鼠肌腱细胞,定期更换培养基并加入维生素C以促进细胞外基质分泌和防止细胞老化。2周后,沿培养皿边缘慢慢卷起细胞片,继续培养1周,使细胞片光滑面与粗糙面充分融合形成圆柱形的组织工程肌腱[7]。

1.2 损伤肌腱模型的制备

损伤肌腱组织来源于SD大鼠髌韧带,做1mm×4mm 全层窗口缺损,自然修复1周。对照组为SD大鼠正常髌韧带组织。

1.3 实时荧光定量PCR检测相关基因的表达

取大鼠损伤自然修复后的肌腱组织和体外构建的组织工程肌腱,以正常肌腱组织作为对照组。采用-actin为内参,实时荧光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)，RT-PCR法检测COL5α1、COL5α2和COL1α1基因的表达。

1.4 siRNA转染大鼠肌腱细胞及分组

由Ambion公司合成干扰COL5α1和COL5α2亚基的siRNA序列[8],用Lipofectamine TM2000转染处于对数生长期的大鼠肌腱细胞。转染干扰COL5α1亚基的siRNA为α1siRNA实验组,转染干扰COL5α2亚基的siRNA为α2siRNA实验组,转染FAM标记的乱序siRNA为对照组。

1.5 RT-PCR法及免疫荧光法检测肌腱细胞相关基因和蛋白的表达

肌腱细胞转染特定siRNA 48h后,收集肌腱细胞,提取RNA,采用actin为内参,RT-PCR法定量分析COL5α1、COL5α2和COL1α1基因的表达。肌腱细胞转染特定siRNA 72h后,免疫荧光法检测COL5α1和COL5α2在蛋白水平的表达。

1.6 肌腱细胞胶原含量测定

将α1siRNA实验组、α2siRNA实验组和对照组培养的肌腱细胞制成组织工程肌腱,用胶原含量测定试剂盒检测胶原含量。

1.7 透射电镜检测肌腱细胞形态结构

将α1siRNA实验组、α2siRNA实验组和对照组培养的肌腱细胞制成组织工程肌腱,制作透射电镜标本,检测内部的胶原原纤维形态结构。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 损伤肌腱与组织工程肌腱中相关基因的表达

损伤肌腱中COL5α1与COL5α2表达均明显升高。同时,组织工程肌腱中COL5α1与COL5α2表达也明显升高,尤其COL5α2表达升高显著(图1)。在损伤肌腱和组织工程肌腱中COL1α1表达没有明显变化。

图1 损伤肌腱、组织工程肌腱与正常肌腱中COL5α1、COL5α2与COL1α1基因的表达

2.2 转染siRNA后肌腱细胞相关基因和蛋白的表达

α1siRNA实验组中COL5α1基因表达被明显抑制,抑制程度约70%,COL5α2与COL1α1表达没有明显改变。α2siRNA实验组中COL5α2基因表达被明显抑制,抑制程度约80%,COL5α1表达被抑制约30%,COL1α1表达被抑制约80%(图2)。

图2 转染48h后,COL5α1、COL5α2和COL1α1在基因水平的表达

转染72h后,免疫荧光法检测结果显示，α1siRNA实验组中COL5α1蛋白表达被明显抑制(图3A～3C),α2siRNA实验组中COL5α2蛋白表达被明显抑制(图3D～3F)。

2.3 组织工程肌腱的胶原含量

胶原含量测定结果显示,α1siRNA实验组与α2siRNA实验组中,组织工程肌腱的胶原含量与对照组相比减少约60%(图4)。

图4 组织工程肌腱的胶原含量分析

图6 转染48h后,COL5α1、COL5α2与COL1α1基因表达的比例分析

图3 转染72h后,COL5α1 (A～C)和COL5α2 (D～F)蛋白的表达

图5 透射电镜检测组织工程肌腱,×73000 (A);胶原原纤维直径直方图,n≥300 (B)

2.4 组织工程肌腱的胶原纤维微观结构

透射电镜结果显示α1siRNA实验组胶原原纤维数量减少,直径变小,轮廓模糊,胶原原纤维形成障碍(图5)。α2siRNA实验组胶原原纤维数量减少,直径变小,但与α1 siRNA实验组相比,胶原原纤维数量多,直径略大,轮廓未模糊(图5),表明COL5α1与COL5α2分别被抑制后,组织工程肌腱中胶原原纤维结构变化不同。

2.5 相关基因表达比例分析

α1siRNA实验组中,COL5α1被抑制约70%,COL5α2与COL1α1没有明显变化,所以COL5α2/COL1α1不变,COL5α1/COL1α1降低。α2siRNA实验组中,COL5α2被抑制约80%,COL5α1下降约30%,COL1α1下降约80%,所以COL5α2/COL1α1不变,COL5α1/COL1α1反而升高。

3 讨论

本实验培养大鼠肌腱细胞,构建无支架的组织工程肌腱。此组织工程肌腱由小直径胶原原纤维构成[7],Ⅴ型胶原表达显著升高,与损伤肌腱类似。利用RNAi法抑制Ⅴ型胶原2个亚基COL5α1和COL5α2的表达。结果表明,siRNA分子通过脂质体转染大鼠肌腱细胞后,有效抑制了COL5α1和COL5α2在基因和蛋白水平的表达,为体外研究下调肌腱细胞Ⅴ型胶原表达提供了可行的实验方法。

本研究通过siRNA抑制肌腱细胞中Ⅴ型胶原2个亚基表达,α1siRNA实验组和α2siRNA实验组胶原含量均下降约60%,表明抑制Ⅴ型胶原后,胶原纤维合成减少。胶原纤维主要由I型胶原蛋白构成,基因检测结果显示,α1siRNA实验组中COL1α1表达没有明显改变,α2siRNA实验组中COL1α1表达下降约80%。α1siRNA实验组和α2siRNA实验组中COL1α1基因表达差异巨大,组织工程肌腱中胶原合成量却相近,表明胶原纤维合成量不是由COL1α1基因表达水平一个因素决定,还受其他因素影响。

肌腱损伤后的自然修复过程中Ⅴ型胶原表达升高[9-11],Ⅴ型胶原可能是肌腱损伤修复的必需因子,但过高表达会使修复组织中胶原原纤维直径明显变小。α1siRNA实验组中COL5α1/COL1α1下降,可能无法达到Ⅴ型胶原与Ⅰ型胶原比值的最低要求,导致胶原原纤维形成障碍。α2siRNA实验组中COL5α1/COL1α1升高,这种变化类似于损伤肌腱修复过程,与对照组相比产生更小直径的胶原原纤维。上述结果表明,COL5α1/COL1α1过高或过低都不利于损伤肌腱修复,只有保持在适当水平才有可能形成大直径胶原原纤维。α1siRNA实验组胶原合成量下降可能是因为COL5α1/COL1α1低于最低要求,胶原原纤维形成障碍导致。α2siRNA实验组胶原合成量下降可能是因为COL1α1表达降低,Ⅰ型胶原蛋白合成不足导致。

总之,本研究利用RNAi法抑制肌腱细胞中Ⅴ型胶原2个亚基表达,检测相关基因变化；构建组织工程肌腱,检测胶原含量和微观形态结构。结果显示,COL5α1/COL1α1可能需要保持在适当水平才能使损伤肌腱再生大直径胶原原纤维,为进一步研究指明了方向。本研究为促进损伤肌腱修复提供了重要的基础生物学信息和潜在的基因治疗手段。