3种乳牙根管充填材料的抗生物膜活性研究

张睿，樊马娟，方丽英，高作滨，刘枫

哈尔滨市儿童医院口腔科，黑龙江哈尔滨 150010

由于乳牙的根管系统复杂且变异程度较大，以及对于儿童牙科操作和隔湿的困难，进而给儿童牙科医生进行乳牙根管治疗带来挑战。乳牙的根尖孔粗大，侧枝根管较多，牙本质小管容易暴露，加上乳牙生理性根吸收可能引起的结构变化，进而增加微生物毒素渗透到牙根表面的可能性[1]。因此，从感染牙齿根管系统中消除生物膜是一个对于临床治疗来说是一个挑战。具有抗菌活性的根管充填材料在促进菌群清除方面起着重要作用。以下几种材料已被用作乳牙根管充填材料。在乳牙中，氧化锌丁香油酚已被广泛使用[2]。由于氧化锌有刺激性强且不易被吸收的缺点，在其中加入抗菌活性和生物相容性较好且易吸收的碘仿或氢氧化钙的产品也已经进入临床使用[3]。Vitapex主要成分是氢氧化钙和碘仿和聚硅氧烷油组成，具有卓越的抗菌活性和X射线阻射性，使用方便不需要预先调制糊剂，随取随用，而且不易污染。采用注射方式易于将糊剂充填至根管中，注射性可加压充填方式解决了细弯几侧枝根管的充填难题，操作易于掌握，省时简便，一次性针尖可预防交叉感染[8]。Vitapex在氢氧化钙糊剂中加入碘仿不仅增强防腐功能，而且两者的生物相容性都很好。该糊剂中还有一定量的硅油，可使充填材料具有良好的流动性和渗透性，有利于进入乳牙丰富的侧副根管中。而氧化锌糊剂虽有良好的安抚镇痛作用，但由于其作用时间短，对远期炎症控制差，且氧化锌可以被根尖渗出物浸润吸收，给炎症的复发创造了一定的机会，此外，氧化锌糊剂对根管壁的黏接性太强，减少了糊剂的流动性，较难进入侧副根管，遗留渗出积储的温床，进一步增加了炎症。

近年来，活性染色和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）已成为一种广泛使用的不同材料对单种和多种细菌生物膜的抗菌效应的测量方法。生物膜是一个嵌入在胞外聚合物基体和附着在固体表面的微生物群落，细菌生长在生物膜中产生持续性感染。微生物侵入根管系统，最终导致牙髓坏死、根尖周炎。在坏死根管内细菌生长主要是游离的形式，根管治疗的成功将取决于这种生物膜是否有效的消除[4]。该研究用活菌染色法和共聚焦激光扫描显微镜染色检测常用乳牙根管材料的抗生物膜的能力。

1 材料与方法

1.1 实验分组

实验分为4组：对照组（去离子水）、氧化锌碘仿组、Vitapex组、氢氧化钙组。

1.2 生物膜的培养

三十六羟磷灰石（HA）培养皿（0.38-inch直径0.06-inch厚度，美国）作为生物膜的培养基。HA培养基加入Ⅰ型牛胶原白（10 mg/mL胶原蛋白）在4℃过夜。从健康成人志愿者中收集龈下菌斑，并在脑心浸液培养基中培养。在分光光度计405 nm处调整细胞密度，密度约为7.5～107每毫升菌落形成单位。在厌氧条件下培养在24孔细胞培养皿，用厌氧袋和厌氧指示剂在37℃条件下使菌斑悬浮。每个孔含有1.8 mL无菌脑心浸液培养基和0.2 mL接种物，样品保存在水中。每周更换1次新鲜的培养基。

1.3 生物膜细菌存活率测定

在培养3周生物膜上，小心地放置一层薄薄的根管充填材料（0.1 g）。然后将标本放入培养箱中，试验期为7 d和30 d（n=3）。用细菌存活试剂盒定量分析。按照制造商的指示在溶液中染色膜。使用激光共聚焦显微镜观察。同时采用双通道成像显示绿色和红色荧光。绿色荧光染色的为活菌，而受损的细菌膜染色产生红色荧光。用Imaris 7.2软件分析活/死的比率。红色荧光到绿色荧光和红色荧光的体积比表明死亡细胞的比例。采用SPSS 17.0统计学软件进行方差分析和Tukey分析死细胞体积的比例。

2 结果

共分析了180个扫描的生物膜区域，分别为红色和绿色荧光的比例。不同根管材料的微生物杀灭效果差异有统计学意义（F＝73.073，P＜0.05）。 致死微生物的比例也取决于暴露时间。在阴性对照组，经过7 d的细菌细胞93%是活菌，30 d后为94%，Vitapex都对生物膜最有效的材料，见表1、图1。

表1 不同根管充填材料对生物膜中死菌体积的比例（±s）

表1 不同根管充填材料对生物膜中死菌体积的比例（±s）

组别7 d 3 0 d对照组氧化锌碘仿组V i t a p e x组氢氧化钙组0.0 8±0.0 6 0.3 5±0.6 4 0.4 8±0.4 3 0.1 6±0.7 8 0.0 6±0.0 4 0.3 4±0.0 8 0.5 1±0.1 4 0.1 9±0.1 0

图1 不同根管充填材料对生物膜中死菌的激光共聚焦结果

3 讨论

乳牙根管充填材料用于的抗菌作用已在琼脂扩散实验或直接接触试验有很多的研究，但这些研究都有很大的局限性，不适合于研究生物膜的微生物杀灭[5-6]。因此，很少有关于这些材料对根管生物膜的研究。到目前为止，只有少数使用激光共聚焦显微镜和双组分的染色法评价根管充填材料对乳牙进行抗菌作用的研究。这种方法目前常用于评价不同材料对根管感染微生物的抗菌效果，并提出了一种快速和相对容易使用的方法[7]。试剂盒中的两种物质在进入正常和损伤细菌细胞的能力是不同的；活的细菌细胞膜完整的绿色荧光，而损伤的细胞膜则为荧光红。认为生物膜的各种不同的细菌存在于根管系统的不可到达区域，并且在这些区域中微生物一般代谢率较低，并且往往对抗菌剂有较强抵抗力[8]。因此，根管充填材料应利用多物种生物膜模型测试其抗菌能力。

该研究结果表明，不同根管材料在杀灭生物被膜的效果上存在显著差异。氢氧化钙对生物膜表现出微弱的影响。氢氧化钙对游离培养中生长的根管细菌有较强潜力。然而，对生物膜的影响是不确定的。此外，冲洗根管的药物一般为次氯酸钠溶液，这样的结果较难维持高浓度的氢氧根离子[9]。

氧化锌碘仿在很短的时间有抗菌作用。尽管有一些研究表明含有氧化锌的物质具有很强的抗菌作用，但其他研究显示只有有限的抗菌活性，这种差异可以用琼脂扩散法中的混杂因素、不同种类的细菌测试和丁香酚的浓度来解释[10]。该研究结果表明，氧化锌对生物膜微生物表现出中等程度的活性。一旦设定了氧化锌，它就没有特别的抗菌作用，这可以解释7 d后暴露的生物膜细菌为什么没有被杀死。

Vitapex在乳牙根管治疗疗效临床和影像学成功可能与在与活体组织接触时，其抗菌性能和快速吸收材料的独特性能有关。我们的研究结果表明，与其他研究一致[11]，认为Vitapex的良好的性能是由于碘仿，因为碘仿单独也导致近70%的生物膜的细菌杀死。

根管充填材料的抗菌效果对于牙髓治疗的成功是至关重要的，它不是理想材料所需要的唯一特性，应该进行更多的研究来评估乳牙牙髓治疗材料的其他生物学特性。