二至方中三萜类成分的含量测定及在大鼠体内的药动学特征

汪华君， 蒋俊， 尹江宁

(1. 江苏大学附属医院药剂科， 江苏 镇江 212001； 2. 江苏大学药学院， 江苏 镇江 212013; 3. 江苏大学附属医院急诊科，江苏 镇江 212001)

糖尿病是由于胰岛素分泌绝对或相对不足，糖代谢紊乱而引起的以高血糖为主要特征的内分泌代谢疾病，是世界三大慢性病之一[1]。糖尿病肾病是由高血糖引起的以微血管损害为主的肾小球病变，是糖尿病的主要致死、致残性微血管并发症之一[2]，有30%～45%的患者最终导致终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)[3]。明代医家所著《医便》中记载“二至丸清上补下第一方，价廉而功极大”，是治疗肝肾阴虚的要药，由墨旱莲和女贞子两味药(1 ∶1)组成。近年来，研究表明二至方具有降血糖的功效[4]。殷越等[5]在实验研究中发现，二至方对于D-半乳糖致衰老大鼠的血糖血脂异常可以发挥较好的作用，且在一定范围内呈量效关系。大量研究证实，血脂血糖异常与糖尿病肾病的发生、肾功能下降以及ESRD的发生相关[6-7]，而糖尿病肾病患者的肾功能下降、蛋白尿增加反过来又会加剧血脂血糖代谢的异常[8-9]。若将二至方应用于降糖方案中，不仅可以调节血糖血脂，而且可以一定程度上改善肾功能，防治糖尿病肾病。二至方中含有丰富的活性三萜类化合物，如齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸等[10-13]。但是，针对二至方中三萜类成分的药代动力学尚不清楚。本研究首次建立了测定二至方中代表性三萜类成分含量的方法，并探讨其在大鼠体内的药动学特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 墨旱莲、女贞子药材购自镇江存仁堂医药连锁有限公司；二至方是按照墨旱莲 ∶女贞子1 ∶1的比例自制；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。齐墩果酸和熊果酸购自西安开来生物科技有限公司(纯度>98.5%)。

1.1.2 实验动物 雌性SD大鼠6只，体重(220±20)g，由江苏大学实验动物中心提供，合格证为SYXK(苏)20130036。

1.1.3 仪器 Agilent 1260 HPLC，脱气装置、G4212A型1290检测器和Chemstation工作站，KQ-250D型医用数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BP211D电子天平(德国赛多利斯公司)；涡旋振荡仪(Vortex-2，美国Scientific Industries公司)；Anke离心机TGL-16G(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.1%甲酸水(90 ∶10，V/V)，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为室温，进样量20 μL。

1.2.2 对照品溶液的配制 称取齐墩果酸和熊果酸各10 mg，精密称定，甲醇溶解、超声助溶后定容至50 mL，即得 2种待测化合物的对照品储备溶液；再将齐墩果酸和熊果酸对照品储备溶液稀释至0.5、1.0、10.0、20.0、40.0和50.0 μg/mL的混合标准品系列溶液。

1.2.3 二至方提取物、大鼠血浆及组织样品的采集与处理 分别称取7个不同批次的二至方样品20 mg，置于25 mL锥形瓶中，加入甲醇10 mL，超声提取40 min，放冷，补充重量，过0.45 μm的微孔滤膜，供含量测定用。二至方提取物采用10倍量80%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并两次提取液，真空干燥，得干燥粉末，备用。

3只SD大鼠正常饲养，给药前12 h禁食不禁水。按照3 g/kg的剂量给予二至方提取物，提取物用0.5%羧甲基纤维素钠制成混悬液灌服，于给药前及给药后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h于眼眶后静脉丛取血0.5 mL，置肝素化的离心管中；另取3只大鼠，在灌胃2 h后，脱颈处死，立即取心、肝、脾、肺和肾组织，并用生理盐水洗净组织浮血，滤纸吸干，称取各组织，加入生理盐水匀浆，制成1.0 g/mL组织匀浆液；取各组织匀浆液和血液样品各 200 μL，分别加入400 μL乙腈，涡流振荡混合，5 000 r/min离心10 min，取上清液，N2吹干。残渣中精密加入200 μL甲醇，涡流振荡2 min，静置，10 000 r/min离10 min，取上清液作为供试品溶液，过0.22 μm滤膜，待HPLC测定。

1.2.4 方法学验证

1.2.4.1 标准曲线及线性范围 取大鼠空白血浆0.1 mL，精密加入10 μL方法“1.2.2”中所配置的不同浓度的混合对照品溶液，按血浆样品的处理方法操作，并进行色谱分析，以峰面积Y对血药浓度X(μg/mL)进行线性回归，得齐墩果酸和熊果酸的回归方程分别为Y=6.510 975 36X+2.180 605 9 (R2=0.999 78)、Y=5.412 280 24X-1.627 312 6(R2=0.999 18)，结果表明齐墩果酸和熊果酸在0.5～50.0 μg/mL范围内线性关系良好。齐墩果酸和熊果酸的定量下限(LOD)分别为 1.24、1.26 μg/mL。代表性的HPLC图谱如图1所示。

1.2.4.2 稳定性和回收率 对于二至方提取物，同一供试品，按供试品溶液的制备方法操作，分别于0、1、2、4、8 h精密吸取方法“1.2.2”中对照品溶液，进样，齐墩果酸和熊果酸峰面积的相对标准偏差分别为0.15%和1.34%，表明供试品溶液稳定性较好；另外，取已知含量的供试品3份，分别按照0.5倍加标量精密加入齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，按照供试品溶液的制备方法处理，测定并计算回收率，结果齐墩果酸和熊果酸的回收率分别为99.8%和102.1%，表明回收率良好。

对于血浆样品，按照“1.2.4.1”项下制备齐墩果酸和熊果酸血浆样本，并按同样方法处理，测得样品峰面积分别为A，另取甲醇0.1 mL，加入10 μL一定浓度的标准工作液，使其与质控样品相同，按血浆样品的处理项下操作，进样测得样品峰面积分别为B，求得血浆中齐墩果酸和熊果酸的提取回收率(A/B)。结果齐墩果酸的提取回收率为82.15%，熊果酸的提取回收率为 83.73%，表明两者的回收率良好。

1.3 数据处理

根据所测得齐墩果酸和熊果酸的血药浓度-时间数据，利用DAS 2.0程序分别计算各自主要的药动学参数，并绘制血药浓度-时间曲线。

A： 齐墩果酸和熊果酸混合对照品；B： 二至方提取物；C： 大鼠灌胃给药二至方提取物后血浆及组织；D： 空白血浆；E： 组织样品的阴性对照。1. 齐墩果酸；2. 熊果酸

图1二至方提取物、大鼠血浆及组织中齐墩果酸和熊果酸的HPLC图谱

2 结果

2.1 二至方中齐墩果酸和熊果酸的含量

测定了7个批次的二至方中齐墩果酸和熊果酸的含量，结果表明齐墩果酸的含量范围在0.67%～4.26%，熊果酸的含量范围在0.21%～1.19%。齐墩果酸和熊果酸均为三萜类成分，且是同分异构体，但是两者含量间的差异较大，齐墩果酸的含量相对较熊果酸高。各批次的含量检测结果见表1。

表1 齐墩果酸和熊果酸在二至方中的分布 n=3， %

2.2 齐墩果酸和熊果酸在组织中的分布

结果表明，大鼠灌胃二至方提取物后，肝、心、脾、肺和肾组织中齐墩果酸的浓度分别为197.60、11.70、1.10、43.70和40.10 mg/L，在肝脏中含量最高；熊果酸的浓度分别为92.90、61.80、37.90、307.50和301.30 mg/L，在肺和肾脏中含量较高。

2.3 齐墩果酸和熊果酸在大鼠体内的药动学特征

测定结果显示，齐墩果酸和熊果酸的达峰时间(Tmax)均为0.5 h，表明其达峰时间相似；齐墩果酸和熊果酸的峰浓度(Cmax)分别为(111.33±10.50) mg/L、(153.72±3.35) mg/L；此外，齐墩果酸和熊果酸的药时曲线下面积[AUC(0-∞)]分别为(342.44±10.15) mg/(L·h)、(589.79±9.49) mg/(L·h)；齐墩果酸和熊果酸的半衰期(t1/2z)分别为 (2.93±0.03) h、(3.19±0.02) h，表明齐墩果酸的体内消除较熊果酸略快。见图2和表2。

图2 大鼠灌服二至方提取物后齐墩果酸和熊果酸的体内药物-时间曲线 (n=3)

3 讨论

本研究最初选用HPLC-MS/MS配备电喷雾离子源建立同时测定齐墩果酸和熊果酸的方法，但是此2个目标成分是同分异构体，HPLC-MS/MS所用的色谱柱为150 mm，两者保留时间、离子碎片和相对丰度比均完全相同，因此难以实现两者的分离。随后，选用HPLC连接250 mm长柱子，并调节流动相比例，最终实现了齐墩果酸和熊果酸的基线分离并满足中药饮片及生物样品的定量要求。

表2 灌胃二至方提取物后大鼠血浆中齐墩果酸和熊果酸的药动学参数 n=3

AUC: 曲线下面积；AUMC: 一阶矩曲线下面积；VRT: 滞留时间方差；MRT: 平均驻留时间

女贞子和墨旱莲2味中药饮片中虽均含有一定量的齐墩果酸和熊果酸，但其主要来源是女贞子[14-17]。由药动学参数可知，齐墩果酸和熊果酸均能在胃肠道被吸收入血，由于齐墩果酸和熊果酸为同分异构体，且结构极其相似，两个甲基都在20位的为齐墩果酸，而两个甲基分别在19、20位是熊果酸，因此其药动学参数也具有一定的相似性。

二至方能够发挥抗糖尿病肾病作用，与其中所含有效成分能否被吸收分布至靶器官(即肾脏组织)以及有效成分在靶器官中的浓度直接相关。根据组织分布的结果，在大鼠肾脏组织中能检出大量的齐墩果酸和熊果酸，其中熊果酸的含量较齐墩果酸更高。研究表明，齐墩果酸能通过降低2型糖尿病大鼠的氧化应激和内质网应激改善糖尿病肾病、保护肾微结构[18-21]。熊果酸能降低血糖、抗氧化和抑制炎症反应从而保护糖尿病所致肾损伤，并能抑制糖尿病肾病的早期损伤[22-24]。因此，齐墩果酸和熊果酸可能是二至方抗糖尿病肾病的重要物质基础，后续工作将进一步探讨齐墩果酸和熊果酸通过保护肾脏中足细胞从而抗糖尿病肾病的机制。