多柔比星联合蛋氨酸脑啡肽对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长抑制及Tau蛋白磷酸化的调节作用

曹振杰

(郑州大学第三附属医院小儿外科，河南 郑州 450052)

神经母细胞瘤是一种儿童颅外肿瘤疾病，5岁以下的婴幼儿是其主要发病人群，抗肿瘤治疗药物的选择对患儿预后恢复及生长发育至关重要[1]。作为常用化疗药物多柔比星可有效杀伤肿瘤细胞，但长期应用患儿耐受性差，对正常组织的不良反应亦比较大，因此成为临床抗肿瘤治疗难以克服的瓶颈[2]。蛋氨酸脑啡肽(methionine enkephalin，Met-ENK)属于阿片类生长因子，除具有免疫调控及镇痛作用外，还可显著抑制肿瘤细胞生长，在多种肿瘤体外细胞试验中具有显著的抗肿瘤作用[3]。Tau蛋白是重要的中枢神经系统蛋白，通过磷酸化进行蛋白功能的调节，有研究[4]显示，Tau蛋白磷酸化可加速神经细胞的凋亡。本研究主要探讨多柔比星联合Met-ENK对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长抑制作用，以及对Tau蛋白磷酸化的调节。

1 材料与方法

1.1SH-SY5Y细胞培养、分组及药物干预神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞由中山大学附属肿瘤医院馈赠。SH-SY5Y细胞以含体积分数10%胎牛血清及青、链霉素的RPMI-1640培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验研究。将密度为5.0×104·mL-1的SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，培养24 h后，阳性对照组SH-SY5Y细胞以1.25 mg·L-1的多柔比星处理，低、中、高剂量实验组SH-SY5Y细胞分别以1.25 mg·L-1的多柔比星+10-7、10-5、10-3mol·mL-1Met-ENK处理，阴性对照组细胞以等量生理盐水处理，各组设8个复孔。

1.2MTT法[4]检测各组SH-SY5Y细胞增殖情况干预0、24、48、72 h后，各孔加20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液，37 ℃孵育4 h，加150 μL二甲基亚砜(DMSO)，采用SpectraMax®M3多功能酶标仪检测各孔490 nm下吸光光度值OD490 nm，计算细胞存活率=阳性对照组和各实验组OD490 nm/阴性对照组OD490 nm×100%。

1.3流式细胞术[5]检测各组SH-SY5Y细胞周期及凋亡情况细胞分组及处理同1.1，干预48 h后收集各组细胞，1 000 r·min-1离心10 min，加500 μL缓冲液悬浮细胞，调整细胞密度为2.0×105/孔，加5 μL Annexin V-FITC避光孵育5 min，加5 μL碘化丙啶(PI)避光孵育5 min，1 h内以FACSCalibur型流式细胞仪检测并记录各组SH-SY5Y细胞凋亡率及细胞周期，实验重复3次。

1.4Hoeschest33258细胞核染色[5-6]检测各组SH-SY5Y细胞凋亡情况细胞分组及处理同1.1，细胞培养48 h后，弃培养基，经预冷多聚甲醛固定15 min，然后加Hoeschest 33258工作液避光孵育15 min，以抗荧光淬灭剂封片，于Leica DMi8-M荧光显微镜下观察阴性对照组、阳性对照组和高剂量实验组SH-SY5Y细胞核染色情况。

1.5WesternBlot法[7]检测各组SH-SY5Y细胞磷酸化Tau(p-Tau)蛋白表达情况细胞分组及处理同1.1，细胞培养48 h后，收集细胞，细胞裂解液裂解细胞，测定总蛋白浓度，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、染色等，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，以Image J软件分析各组SH-SY5Y细胞p-Tau蛋白表达。

2 结果

2.1各组SH-SY5Y细胞增殖情况与阴性对照组比较，干预24、48、72 h后，阳性对照组和各实验组细胞存活率明显降低，且各实验组低于阳性对照组，实验组细胞活率随Met-ENK浓度的增大逐渐降低(P<0.05)。见图1。

2.2各组SH-SY5Y细胞周期分布及凋亡与阴性对照组比较，阳性对照组和各实验组凋亡率、G0/G1期细胞比例显著升高，且中、高剂量实验组高于阳性对照组(P<0.05)，随Met-ENK作用浓度增加实验组凋亡率、G0/G1期细胞比例呈逐渐升高趋势(P<0.05)；与阴性对照组比较，阳性对照组和各实验组S期细胞比例显著降低，且中、高剂量实验组低于阳性对照组(P<0.05)，随Met-ENK作用浓度增加实验组S期细胞比例呈逐渐降低趋势(P<0.05)；而阳性对照组及各实验组G2/M期细胞比例变化不显著(P>0.05)。见表1。

表1 各组SH-SY5Y细胞周期分布及凋亡 %

注：与阴性对照组比较，1)P<0.05；与阳性对照组比较，2)P<0.05

2.3各组SH-SY5Y细胞凋亡情况Hoeschest 33258细胞核染色显示，阴性对照组SH-SY5Y细胞核蓝色荧光染色分布均匀；而阳性对照组和高剂量实验组细胞浓缩致密，颗粒状凋亡细胞核数量较对照组明显增多，细胞核聚集、断裂成块。见图2。

图2 各组SH-SY5Y细胞凋亡情况(×200)

2.4各组SH-SY5Y细胞p-Tau蛋白表达情况阴性对照组，阳性对照组，低、中、高剂量实验组细胞p-Tau蛋白相对表达量分别为0.89±0.11、0.95±0.16、1.11±0.31、1.21±0.29、1.52±0.33，与阴性对照组比较，阳性对照组和低、中、高剂量实验组细胞p-Tau蛋白相对表达量明显升高，中、高剂量实验组高于阳性对照组，实验组细胞p-Tau蛋白相对表达量随着Met-ENK浓度的增大逐渐升高(P<0.05)。见图3。

图3 各组SH-SY5Y细胞p-Tau蛋白表达情况

注：A：阴性对照组；B：阳性对照组；C：低剂量实验组；D：中剂量实验组；E：高剂量实验组

3 讨论

随着人类生活方式的转变及生活压力的增大，恶性肿瘤的发生率不断升高，成为严重威胁人类生命健康安全的事件之一，因此抗肿瘤药物的研究成为临床迫在眉睫的重要任务。Met-ENK是由5种氨基酸组成的天然肽类化合物，可特异性结合肿瘤细胞表面上的受体，并发挥抑制肿瘤恶性增殖的作用，同时其还具有传统阿片生长因子所具有的免疫调控、镇痛等药理作用。Abate等[5]研究表明，Met-ENK对移植肿瘤细胞的裸鼠具有较好抑制肿瘤细胞生长的作用，同时可延长荷瘤动物的生存时间。杨峥维等[6]研究显示，Met-ENK可抑制包括肝癌、肺癌、结肠癌、口腔癌、乳腺癌等在内的8种恶性肿瘤细胞的体外增殖，但其抑制强度不同，且与药物作用时间相关。

本研究中采用MTT法检测各组SH-SY5Y细胞增殖情况，结果显示，干预24、48、72 h后，阳性对照组和各实验组细胞存活率明显降低，且各实验组低于阳性对照组，实验组细胞存活率随着Met-ENK浓度的增大逐渐降低，表明Met-ENK联合多柔比星可更有效地抑制SH-SY5Y细胞的增殖，降低细胞存活率，且具有Met-ENK剂量依赖性。李彦博等[7]研究表明，Met-ENK可将肿瘤细胞周期抑制于G0/G1期，其是通过上调抑癌基因P53、P16和细胞周期蛋白激酶相关的抑制因子P21表达，下调磷酸Rb蛋白表达而实现。本研究结果中，阳性对照组和各实验组凋亡率、G0/G1期细胞比例较阴性对照组升高，S期细胞比例降低，同时说明Met-ENK联合多柔比星可促进肿瘤细胞的凋亡，并将细胞阻止于G0/G1期；Hoeschest 33258细胞核染色也同样显示，阳性对照组和实验组细胞凋亡现象较阴性对照组更为突出。Tau蛋白主要在神经细胞中广泛表达，属于微管蛋白家族成员之一，可被磷酸化、乙酰化、氧化、糖基化等修饰，其中过度磷酸化可使Tau蛋白在神经细胞内堆积，促进神经细胞损伤和凋亡[8-9]。本研究结果中，与对照组比较，阳性对照组和低、中、高剂量实验组细胞p-Tau蛋白相对表达量明显升高，中、高剂量实验组低于阳性对照组，且具有一定的剂量依赖性。这表明Met-ENK可能是通过加速Tau的磷酸化促进肿瘤细胞凋亡，进而起到较好的抗肿瘤作用。

综上所述，多柔比星联合Met-ENK可抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长，并促进其凋亡，这可能与降低Tau蛋白磷酸化水平有关，但关于Met-ENK的抗肿瘤作用机制还可能存在其他的途径，这需要临床进一步研究加以确认。