烟草半胱氨酸蛋白酶的特性和结构分析

杨柳　赵爽　殷雪艳　刘彪　罗万麟

摘 要：通过生物大数据和检测工具，对烟草半胱氨酸蛋白酶的序列特征、亚细胞定位、二级结构和三级结构进行分析。结果显示，烟草半胱氨酸蛋白酶均具有信号肽，且含有组织蛋白酶前肽抑制剂结构域和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶；经初次亚细胞定位，NtCP-1，NtCP-2，NtCP-3和NtCP-4定位于细胞质，NtCP-5定位于液泡；二级结构中，NtCP-1，NtCP-2和NtCP-5的α-螺旋比例最大，而NtCP-3和NtCP-4以無规则卷曲比例最大；三级结构N-端聚集较为疏松，其二级结构以α-螺旋为主，C-端的二级结构以β-折叠为主。

关键词：烟草；半胱氨酸蛋白酶；结构；特性

中图分类号：S517 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.001

Characterization and Structure Analysis of Tobacco Cysteine Protease

YANG Liu， ZHAO Shuang， YIN Xueyan， LIU Biao， LUO Wanlin

（Liangshan Tobacco Company， Xichang， Sichuan 615000， China）

Abstract： Tobacco cysteine protease sequence characteristics， subcellular localization， secondary structure and tertiary structure were analyzed with large biological data and detection tools. The results showed that tobacco cysteine protease had a signal peptide， and contained a cathepsin propeptide inhibitor domain and a papain family cysteine protease. The initial subcellular localization， NtCP-1， NtCP-2， NtCP-3 and NtCP-4 were located in cytoplasm， and NtCP-5 was located in the vacuole. In the secondary structure， NtCP-1， NtCP-2 and NtCP-5 had the largest proportion of alpha helix， while NtCP-3 and NtCP-4 had the largest specific gravity in the random coil. The tertiary structure had looser N-terminal aggregation， its secondary structure was mainly α-helix， and the C-terminal secondary structure was mainly β-sheet.

Key words： tobacco； cysteine protease； structure； characteristics

半胱氨酸蛋白酶具有降解和储存蛋白[1-2]、抵抗生物或非生物胁迫[3-6]、参与细胞的衰老和程序性的死亡等作用[7-8]，该蛋白酶一般在细胞质中生成前体性蛋白，再通过自身信号肽，转运到特定的亚细胞结构如细胞壁和液泡等[9-10]，一般半胱氨酸的蛋白酶具有相对保守的结构域[11]，位于叶绿体的半胱氨酸蛋白酶降解核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）[12]。

烤后烟叶颜色是烟草收购标准之一[13]，主要受鲜烟叶色素含量和烤中烟叶变黄的影响，即受细胞衰老和色素的影响，而半胱氨酸蛋白酶与植物的细胞衰老和色素降解有关[14]。本研究对烟叶半胱氨酸蛋白酶的特性和结构进行分析，旨在为其进一步研究和应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 烟草半胱氨酸蛋白酶家族成员的获取

运用NCBI[15]数据库，检索并提取烟草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列，其登录号分别为ABW71226.1，BAA96501.1，ACB70409.1，AAW7866 0.1和ADV41672.1，并分别对其进行命名NtCP-1，NtCP-2，NtCP-3，NtCP-4和NtCP-5[16]。

1.2 方 法

采用结构域分析工具SMART[17]，对烟草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸数、信号肽位置、结构域成分以及结构域分布进行分析；运用TargetP 1.1在线服务[18]，获取烟草半胱氨酸蛋白酶的亚细胞结构；采用NPSA-PRABI工具[19]，测定烟草半胱氨酸蛋白酶的β-转角、β-折叠、α-螺旋和无规则卷曲，分析序列的二级结构；采用SWISS-MODEL工具[20]，根据同源相似原理，构建烟草半胱氨酸蛋白酶的三级结构。

2 结果与分析

2.1 烟草半胱氨酸蛋白酶的序列特征

通过分析蛋白酶的氨基酸序列，有利于了解其功能特性，因此，采用SMART对NtCP进行序列特征的分析，结果如表1所示。NtCP的氨基酸数量无明显波动，介于349～361，其中，NtCP-1和NtCP-2相同（360），NtCP-3和NtCP-4相同（361），NtCP-5的氨基酸数最小（349）；NtCP各成员都含有信号肽，均位于N-端；均含有组织蛋白酶前肽抑制剂结构域（Inhibitor_I29），但存在的位置有所不同，其中，NtCP-1和NtCP-2的所在位置相对靠后，处于61～121，而NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5的所在位置较为靠前，处于38～99；均含有木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶（Pept_C1），其位置分布规律同Inhibitor_I29较为相似。

2.2 烟草半胱氨酸蛋白酶的亚细胞定位和二级结构分析

为明确NtCP位于烟草中的亚细胞结构，对其氨基酸序列进行分析，详情如表2所示。NtCP-1、NtCP-3和NtCP-4可能定位于细胞质、内质网、液泡或类囊体结构中，其中NtCP-1和NtCP-4定位于细胞质的可能性最大，而NtCP-3定位于细胞质和内质网的可能性最大；NtCP-2可能定位于细胞质、液泡、类囊体或细胞外，但定位于细胞质内的可能性较大；NtCP-5可能定位于液泡、类囊体或细胞外，可能主要位于液泡内。为进一步探究NtCP二级结构的稳定性，对蛋白序列中的β-转角、β-折叠、α-螺旋和无规则卷曲分布及其成分进行分析，结果如图1所示。β-转角于序列内的分布较为分散，其在NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5序列内所占比例依次为11.67%，11.94%，10.25%，10.25%和10.03%；β-折叠一般存在于第50位氨基酸序列之后，其于各序列中所占比例依次为20.00%，18.89%，20.22%，19.11%和14.90%；α-螺旋主要分布在氨基酸序列的0～100和150～250，所占比重依次为38.06%，39.17%，30.47%，31.86%和39.83%；无规则卷曲无明显分布规律，所占比重依次为30.28%，30.00%，39.06%，38.78%和35.24%。

2.3 煙草半胱氨酸蛋白酶的三级结构分析

利用HHBlits和Blast的同源比对法，以NtCP的氨基酸序列为依据，检索SWISS-MODEL的三级结构数据库，经筛选，以蛋白原的晶体结构，以及2.70 Amb a 11和2.05 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一种主要的豚草花粉过敏原）的晶体结构为模板，其序列分别1cs8.1，5egw.1，45ef4.1，构建NtCP的三级结构，结果如图3所示。NtCP-1和NtCP-2依据蛋白原的晶体结构，构建其相关的三级结构（图2-A），NtCP-1和NtCP-2氨基酸序列的覆盖率均为0.82%，且含有的β-折叠、β-转角和α-螺旋数依次为21，27，11个；NtCP-3和NtCP-4依据2.70 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一种主要的豚草花粉过敏原）的晶体结构，构建其相关的三级结构（图2-B），其序列的覆盖率均为0.92%，NtCP-3二级结构数依次为17，35，12个，NtCP-4的依次为18，37，12个；NtCP-5依据的晶体结构为2.05 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一种主要的豚草花粉过敏原），构建三级结构（图2-C），为单体，且具有4组GOL配体，序列的整体覆盖率为0.89%，其二级结构数依次为18，35，14个。NtCP的三级结构均以N-端聚集较为疏松，且N-端的二级结构以α-螺旋为主，C-端的二级结构以β-折叠为主。

3 结论与讨论

通过对烟草半胱氨酸蛋白酶的序列特征分析可知，NtCP均含有信号肽，即属于分泌蛋白，且经过初次亚细胞定位，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均位于细胞质，NtCP-5位于液泡；二次定位之后，存在亚细胞的位置发生变化，NtCP-1和NtCP-2定位于液泡，NtCP-3定位于内质网和类囊体，NtCP-4定位于内质网，而NtCP-5被分泌于细胞外。因此，推断NtCP的功能具有多样性[12]。烟草半胱氨酸蛋白酶均含有2个功能结构域，分别为组织蛋白酶前肽抑制剂结构域和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶，说明该蛋白具有较高的保守性，且具有2种蛋白的功能[21]；NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5的α-螺旋比例均最大，有利于保证三级结构的稳定，而NtCP-3和NtCP-4以无规则卷曲的比例最大，不利于三级结构的稳定[16]；N-端的二级结构以α-螺旋为主，C-端的二级结构以β-折叠为主，表明NtCP的功能域可能位于中间和C-端序列。

参考文献：

[1]BECKER C， SENYUK V I， SHUTOV A D， et al. Proteinase A， A storage-globulin-degrading endopeptidase of vetch （ Vicia Sativa， L.） seeds， is not involved in early steps of storage-protein mobilization[J]. European journal of biochemistry， 1997， 248（2）： 304-312.

[2]GRUDKOWSKA M， ZAGDASKA B. Multifunctional role of plant cysteine proteinases[J]. Acta biochimica polonica， 2004， 51（3）： 609-624.

[3]HAO L， HSIANG T， GOODWIN P H. Role of two cysteine proteinases in the susceptible response of Nicotiana benthamiana to Colletotrichum destructivum and the hypersensitive response to Pseudomonas syringae pv. tomato[J]. Plant science， 2006， 170（5）： 1001-1009.

[4]ROJO E， MARTN R， CARTER C， et al. VPEgamma exhibits a caspase-like activity that contributes to defense against pathogens[J]. Current biology cb， 2004， 14（21）：1897.

[5]MACIEL F M， SALLES C M C， RETAMAL C A， et al. Identification and partial characterization of two cysteine proteases from castor bean leaves （Ricinus communis L.） activated by wounding and methyl jasmonate stress[J]. Acta physiologiae plantarum， 2011， 33（5）：1867-1875.

[6]SIMOVASTOILOVA L， VASEVA I， GRIGOROVA B， et al. Proteolytic activity and cysteine protease expression in wheat leaves under severe soil drought and recovery[J]. Plant physiol biochem， 2010， 48（2/3）：200-206.

[7]KUSAKA K， TADA Y， SHIGEMI T， et al. Coordinate involvement of cysteine protease and nuclease in the executive phase of plant apoptosis[J]. Febs letters， 2004， 578（3）： 363-367.

[8]BHALERAO R， KESKITALO J， STERKY F， et al. Gene expression in autumn leaves[J]. Plant physiology， 2003， 131（2）： 430-442.

[9]FISCHER J， BECKER C， HILLMER S， et al. The families of papain- and legumain-like cysteine proteinases from embryonic axes and cotyledons of Vicia seeds： developmental patterns， intracellular localization and functions in globulin proteolysis[J]. Plant molecular biology， 2000， 43（1）： 83-101.

[10]OKAMOTO T， MINAMIKAWA T. A vacuolar cysteine endopeptidase （SH-EP） that digests seed storage globulin： Characterization， regulation of gene expression， and posttranslational processing[J]. Journal of plant physiology， 1998， 152（6）： 675-682.

[11]吳建忠.辐射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因生物信息分析[J]. 西部林业科学， 2015（5）： 1-7.

[12]闫龙凤，杨青川， 韩建国， 等. 植物半胱氨酸蛋白酶研究进展[J]. 草业学报， 2005（5）： 11-19.

[13]闫新甫， 马建伟， 王英元， 等.卷烟企业调入烟叶的等级质量分析[J]. 烟草科技， 2006（8）： 55-59.

[14]UEDA T， SEO S， OHASHI Y， et al. Circadian and senescence-enhanced expression of a tobacco cysteine protease gene[J]. Plant molecular biology， 2000， 44（5）：649.

[15]EDGAR R， DOMRACHEV M， ALEX E， et al. Gene expression omnibus： NCBI gene expression and hybridization array data repository[J]. Nucleic acids research， 2002， 30（1）： 207-210.

[16]陈二龙， 苏家恩， 范志勇， 等. Bright Yellow 2烤烟热激蛋白90生物信息学分析[J]. 南方农业学报， 2017， 48（10）： 1734-1740.

[17]SCHULTZ J， MILPETZ F， BORK P， et al. SMART， a simple modular architecture research tool： identification of signaling domains[J]. Proceedings of the national academy of sciences， 1998， 95（11）： 5857-5864.

[18]ZYBAILOV B， RUTSCHOW H， FRISO G， et al. Sorting signals， n-terminal modifications and abundance of the chloroplast proteome[J]. PloS one， 2008， 3（4）： e1994.

[19]赵洁， 赵立卿， 巩校东，等. 玉米大斑病菌Homeobox转录因子家族全基因组鉴定及其表达规律分析[J].中国农业科学， 2017， 50（4）： 669-678.

[20]GUEX N， PEITSCH M C， SCHWEDE T. Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer： A historical perspective[J]. Electrophoresis， 2009， 30（S1）： 162-173.

[21]刘回民，陈方奇，刘景圣. 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的研究进展[J]. 食品工业， 2014（12）： 222-225.