饲料中脂肪水平对团头鲂幼鱼生长性能、血清 生化指标及黏蛋白基因表达的影响

习丙文 陆春云 任鸣春 米海峰 谢 骏*

(1. 农业部淡水渔业与种质资源利用重点实验室，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，无锡214081； 2. 南京农业大学无锡渔业学院，无锡214081；3. 通威股份有限公司, 成都610000)

黏蛋白(mucin)是黏液的重要组成部分，主要由胃肠道、呼吸道和尿道等器官黏膜组织的杯状细胞和潘氏细胞所分泌，是动物机体抵御外部病原菌入侵的重要物理屏障[1-2]。在自然界，动物与微生物普遍共生，动物机体分泌的黏蛋白对自身防御病原感染具有重要作用[3]。目前相关的报道主要集中在哺乳类和禽类，而鱼类黏蛋白的研究则较少。大多数鱼类黏蛋白研究主要针对黏液中溶菌酶、免疫球蛋白、抗菌多肽等成分[4]。相较于陆生动物，鱼类与水环境中的微生物存在紧密共生关系，为阻挡病原菌的侵袭，鱼类在体肠道、表皮、鳃等组织器官上皮覆盖着一层黏液[5]。近年来关于陆生动物黏蛋白的研究表明，饲粮中碳水化合物的含量对动物肠道黏蛋白的分泌有影响；饥饿处理会改变黏蛋白在动物小肠内的分布，进而可能影响动物肠道消化和机体免疫[6-7]。

团头鲂是重要的大宗淡水养殖品种，以湖北、江苏等地养殖产量最高。在一些高密度养殖地区零星发生的黏液减少、细菌性出血等疾病严重阻碍该品种的健康养殖发展[8-9]。团头鲂在养殖过程中出现体表黏液减少的问题，可能是由于养殖环境(pH、氨氮或硝酸盐)胁迫或者是营养或苗种原因造成的。但目前关于鱼类黏液分泌调控研究相对缺乏，团头鲂体表黏液减少的原因仍然需要不断探讨。本试验以团头鲂幼鱼为研究对象，分析饲料不同脂肪水平对团头鲂幼鱼免疫力和肠道黏蛋白2(Muc2)和表皮黏蛋白5b(Muc5b)基因表达的影响，以期为团头鲂养殖中的疾病防控提供基础理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验鱼和试验设计

试验用团头鲂幼鱼来自南京农业大学无锡渔业学院南泉实验基地，暂养在池塘网箱中。7 d后，选取540尾活力强、个体规格均匀、初始体重为(10.0±0.5) g的团头鲂幼鱼，随机分为6组，每组3个重复，每个重复(网箱)30尾鱼，分别投喂脂肪水平为2.29%、4.29%、6.29%、8.29%、10.29%、12.29%的等氮等能试验饲料。试验饲料组成及营养水平见表1。

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)

1)预混料为每千克饲料提供 The premix provided the following per kg of diets: Cu (as CuSO4·5H2O) 2.5 g，Fe (as FeSO4·7H2O) 28 g，Zn (as ZnSO4·7H2O) 22 g，Mn (as MnSO4·4H2O) 9 g，Na (as Na2SeO3) 0.045 g，K (as KI) 0.026 g，Co (as CoCl2·6H2O) 0.1 g，VA 900 000 IU，VD 250 000 IU，VC 5 000 mg，VK3220 mg，VB1320 mg，VB21 090 mg，VB65 000 mg，VB12116 mg，生物素 biotin 50 mg，泛酸盐 pantothenate 1 000 mg，叶酸 folic acid 165 mg，胆碱 choline 60 000 mg，肌醇 inositol 15 000 mg，烟酸 niacin acid 2 500 mg。

2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 饲养管理

养殖池塘水深约2.5 m，养殖网箱规格为2.0 m×1.0 m×1.5 m。试验开始后，每天定时定点投喂4次，日投喂量为鱼体重的3%～5%，具体投喂量根据鱼摄食和天气情况作适当调整，每次投喂以鱼不剩残料为准。养殖试验期间，池塘水温为25.5～30.0 ℃，pH为7.1～7.6，氨氮含量<0.1 mg/L，溶氧含量>5 mg/L，亚硝酸盐含量<0.06 mg/L。整个养殖试验8周。

1.3 样品的采集与处理

养殖结束后禁食24 h，捞取各网箱试验鱼，用MS-222(150 mg/L, Sigma)麻醉，记录鱼的数量和重量。从各网箱随机选取4尾鱼，用一次性注射器尾静脉采血，测量体长、体重，迅速将鱼在冰盘上解剖，分离内脏和肝脏称重；剪取0.1 g肝脏浸入1 mL RNAiso Plus(TaKaRa)的离心管中，-80 ℃冻存备用；将剩余肝脏装入自封袋，-20 ℃保存备用；剪取肠道和表皮组织浸入1 mL RNAiso Plus中，-80 ℃冻存备用。血液离心(4 ℃，10 000 r/min，5 min)后，血清-20 ℃冻存备用。

1.3.1 血清生化指标的测定

血清皮质醇(cortisol)含量采用MAGLUMI1000全自动化学发光免疫分析仪进行测定。血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均在迈瑞BS-400全自动生化分析仪上进行检测。检测所用试剂盒购自深圳迈瑞生物有限公司。

1.3.2 肝脏抗氧化指标的测定

肝脏样品解冻后用4 ℃生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重；取适量肝脏按1∶9的比例匀浆。将匀浆液离心(4 ℃，5 000 r/min，10 min)，取上清液-70 ℃保存备用。肝脏丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)活性均采用试剂盒测定。检测所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 总RNA提取和cDNA制备

样品(<0.1 g)用高通量组织破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)充分匀浆后，取上清样品。总RNA提取严格参照RNAiso Plus使用步骤。获得的RNA用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)检测质量及浓度，选取OD260/280值在1.8～2.0的样品，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)去除残留基因组DNA，并用50 ng/μL的RNA进行反转录，获得的cDNA在-20 ℃保存备用。

1.3.4 实时荧光定量PCR分析

基因表达分析采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法，所用引物见表2，内参基因选用β-肌动蛋白(β-actin)[10]。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。qRT-PCR反应试剂采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)，在ABI PRISM 7500 Real-time PCR System仪器上进行检测，反应程序参数设置参照薛春雨等[5]。阴性对照以灭菌双蒸水代替cDNA模板；每个样品设置3个重复。通过相对标准曲线法定量基因表达。

表2 实时荧光定量PCR所用引物

1.4 攻毒试验

采样后剩余的团头鲂幼鱼继续饲养7 d，各组随机选取30尾，用本实验室分离保存的致病嗜水气单胞菌株进行腹腔注射攻毒[11]。每尾鱼注射0.1 mL菌液(细菌浓度107CFU/mL)，观察并记录攻毒14 d内鱼的死亡情况。

1.5 数据统计与分析

2 结 果

2.1 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼生长性能的影响

如表3所示，6.29%和8.29%组增重率(WGR)显著高于其他各组(P<0.05)，8.29%组肥满度(CF)显著高于其他各组(P<0.05)，6.29%和8.29%组饲料系数(FCR)显著低于其他各组(P<0.05)，8.29%组肝体比(HSI)显著高于10.29%组(P<0.05)；各组间存活率、脏体比(VSI)无显著差异(P>0.05)。

表3 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼生长性能和形体指标的影响

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Values with different letter superscripts in the same row mean significantly different (P<0.05). The same as below.

2.2 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼血清生化指标的影响

如表4所示，血清皮质醇含量及ALT和AST活性随着饲料脂肪水平的升高呈逐渐上升的趋势。12.29%组血清皮质醇含量及ALT和AST活性最高，显著高于2.29%、4.29%、6.29%和8.29%组(P<0.05)，但与10.29%组没有显著差异(P>0.05)。

表4 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼血清生化指标的影响

2.3 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼肝脏抗氧化指标的影响

如表5所示，随着饲料中脂肪水平从2.29%升高到8.29%，鱼体肝脏中SOD、CAT活性和GSH含量呈上升趋势，8.29%组显著高于2.29%组(P<0.05)；而GR活性在6.29%组最高，除8.29%组外，显著高于其他各组(P<0.05)；MDA含量则随着饲料中脂肪水平上升呈现先下降后升高的趋势，在6.29%组含量最低，显著低于2.29%和12.29%组(P<0.05)。

2.4 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼Muc2、Muc5b基因表达的影响

如图1和图2所示，随着饲料中脂肪水平的增加，肠道Muc2与表皮Muc5b基因的表达量均呈现升高的趋势；其中，Muc2基因的最高表达量出现在12.29%组，显著高于其他各组(P<0.05)；Muc5b基因表达量在8.29%组最高，与12.29%组没有显著性差异(P>0.05)，但显著高于其他各组(P<0.05)。

表5 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼肝脏抗氧化指标的影响

柱状图标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Bars with different letters mean significantly different (P<0.05). The same as below.

图1饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼肠道Muc2基因表达的影响

Fig.1 Effects of dietary lipid level on intestinalMuc2 gene expression of juvenile blunt snout bream (Megalobramaamblycephala)

2.5 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼感染嗜水气单胞菌后死亡率的影响

如图3所示，2.29%和12.29%组死亡率较高，6.29%和8.29%组死亡率较低，且显著低于除4.29%组外的其他各组(P<0.05)。

3 讨 论

饲料脂肪水平对养殖水生动物生长、发育和繁殖都有显著影响；在鱼体的不同生长阶段和生活季节对饲料脂肪的需求都存在显著差异。该研究对团头鲂幼鱼进行为期8周的投喂研究结果表明，长期投喂饲料脂肪水平为6.29%～8.29%的团头鲂幼鱼生长的更好，饲喂该脂肪水平饲料的团头鲂幼鱼在受到嗜水气单胞菌感染后的死亡率也最低，这与蒋阳阳等[12]的研究结果相一致。笔者在养殖调研中也发现团头鲂养殖的商品饲料中脂肪水平多数控制在7%左右。

图2 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼表皮 Muc5b基因表达的影响Fig.2 Effects of dietary lipid level on skin Muc5b gene expression of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala)

养殖过程中鱼体应激严重影响鱼的生长、健康和疾病的发生。皮质醇和儿茶酚胺激素含量是动物重要的应激指标[13]。机体皮质醇和儿茶酚胺含量的升高会引起血压和血糖含量升高，糖原降解等，短期应激对免疫有促进作用，长期应激造成机体免疫抑制作用[14]。养殖过程中不合适的放养密度、溶解氧含量、水质等因素都对养殖水生动物造成严重应激[15-16]。饲料营养不能满足养殖鱼类需求也会造成应激。Vielma等[17]研究表明，长期投喂过高碳水化合物的饲料不利于欧洲鲑(Coregonuslavaretus)生长；任鸣春等[18]研究表明，投喂淀粉水平超过36.3%的饲料对团头鲂的生长和抗应激有抑制作用。

图3 饲料脂肪水平对团头鲂幼鱼感染嗜水气单胞菌后死亡率的影响Fig.3 Effects of dietary lipid level on death rate of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) after challenged with Aeromonas hydrophila

该试验结果表明，血清皮质醇含量随着饲料中脂肪水平的增加呈现逐渐上升的趋势，并在脂肪水平为12.29%时达到最高。ALT和AST是鱼体血液中2个重要的转氨酶。ALT活性增加，表示肌肉组织或者心脏发生功能障碍，而AST活性增加，则表示肝脏出现功能障碍[19]。该试验结果显示鱼体血清ALT和AST的活性均随着饲料中脂肪水平的增加而上升。在罗非鱼的研究中也呈现出一致的结果[20]。较低或较高饲料脂肪水平都会引起鱼体抗病力下降，病原感染死亡率升高。

Muc2主要分布在动物肠道，在肠道营养吸收和疾病发生中发挥重要作用[21-25]。研究表明饲料中添加β-葡聚糖可以有效提高鸡和猪肠道中Muc2基因的表达量[26-27]。本试验结果发现，随着饲料脂肪水平的增加，肠道Muc2基因的表达量呈现不断上升的趋势，表明高脂肪水平可以提高团头鲂幼鱼肠道Muc2基因的表达。尽管肠道黏蛋白分泌增加的具体作用不是很清楚，但肠道增厚的黏液层必将影响营养吸收。因此，投喂高脂肪水平的饲料引起的肠道Muc2基因表达量上调，可能是鱼体对营养吸收的自我调控。

鱼体表皮黏液在调节渗透压、抵御病原侵袭等方面发挥重要作用[28-32]。表皮黏液成分非常复杂,包含有黏蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶、凝集素等，其中Muc5b是最主要的骨架成分[5]。因此，Muc5b基因表达量的高低影响着鱼体表黏液的多少。该研究结果表明，随着饲料脂肪水平的升高，团头鲂幼鱼表皮Muc5b基因的表达量呈现先上升后下降趋势，8.29%试验组表达量最高。饲料中过低和过高的脂肪水平都会降低体表黏蛋白的表达。

团头鲂幼鱼阶段最适饲料脂肪水平6.29%～8.29%,这与养殖生产中团头鲂商品饲料的脂肪水平相近。因此，商品饲料脂肪水平可能不是引起团头鲂体表黏液减少的主要原因。

4 结 论

在本试验条件下，饲料脂肪水平在6.29%～8.29%时，团头鲂幼鱼生长性能、抗病力和表皮Muc5b基因表达量最高。