Klotho蛋白对氧化应激的影响及可能机制

常雅琦 文 敏,2 赵 华 陈小玲 田 刚 刘光芒 蔡景义 贾 刚*

(1.四川农业大学动物营养研究所，成都611130；2.西藏职业技术学院畜牧兽医系，拉萨850000)

研究发现，机体内氧化和抗氧化防御系统之间的平衡受到外界环境的干扰时，便会发生氧化应激。此时，机体组织脂质过氧化水平升高，引发DNA氧化损伤，蛋白质表达异常，还可诱导细胞凋亡的发生，是细胞乃至个体衰老的一个重要诱因[1-2]，轻则对机体造成氧化损伤和生产性能下降，重则会诱导炎症发生，影响动物的健康，甚至导致动物发病和死亡[3]。因此，挖掘和利用具有抗氧化功能的基因和蛋白成为当今营养学家重点关注的问题。近年来的研究表明，Klotho基因及其蛋白可以提高机体的抗氧化、抗衰老能力[4]，它是Kuro-o等[5]发现的一个与人类衰老密切相关的基因，它在小鼠中的缺失或突变会产生多种类似于人类衰老的表型；相反，该基因的过表达能够延长小鼠的寿命[6]，增强小鼠抵抗氧化应激能力[4]，表明Klotho是具有抗细胞凋亡、抗衰老作用的基因。后续研究表明，Klotho蛋白还具有多种生物学活性，包括参与钙磷稳态[7]、抑制炎症发生[8]、抑制氧化应激和细胞凋亡等。本文主要就Klotho蛋白对氧化应激的作用及调控氧化应激的可能机制进行综述，以期为畜牧生产中通过调控Klotho的表达缓解氧化应激提供理论依据。

1 Klotho的结构及其表达

1.1 Klotho的发现

Klotho是Kuro-o等[5]在模拟人类衰老的小鼠模型上鉴定并发现的新基因，由于它的缺失或突变涉及多种衰老表型，包括生长停滞、寿命缩短、运动功能减退、脑垂体畸形、骨质疏松、皮肤萎缩等，且小鼠于2月龄死亡，因此以古希腊神话中纺织生命之线女神的名字——Klotho命名[5]，以纺织丝线的长度来喻其寿命的长短。

1.2 Klotho的结构和功能

在人类、小鼠、大鼠的Klotho基因编码区有5个外显子和4个内含子，分别转录3 036、3 042、3 042个碱基的mRNA。另外，在外显子3区有一个可变剪接位点，因此小鼠和人类Klotho基因编码跨膜型和分泌型Klotho蛋白[5,9]。小鼠Klotho基因定位于染色体的13q12，其启动子区缺乏TATA盒[10]，Klotho启动子中缺失的TATA盒与肾特异性钙黏蛋白(Ksp-cadherin)启动子相似[10]。Klotho的mRNA存在一个可变剪切位点，因此Klotho可产生2种蛋白：一种是跨膜型Klotho蛋白，它由1 014个氨基酸组成，包括N末端信号序列、C末端跨膜结构域和短的细胞质结构域以及胞外结构域[11]。跨膜型Klotho蛋白与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)作为成纤维细胞生长因子23(FGF23)的共受体，介导FGF23发挥生物学活性，从而调节磷代谢稳态[12]。另一种是分泌型Klotho蛋白，它由550个氨基酸组成，只含有N末端信号序列和胞外区KL1，无胞外区KL2、跨膜区和胞内区[11]。分泌型Klotho蛋白可以抵抗炎症反应、调节生长激素的分泌[13]、抑制氧化应激和细胞凋亡等。

1.3 Klotho基因的表达

小鼠的Klotho基因在肾脏中高表达，在垂体、胎盘、骨骼肌、膀胱、胰腺、睾丸、卵巢、结肠及内耳等组织中低表达[14-16]，以编码跨膜型Klotho蛋白为主[17]；大鼠的Klotho基因在肾脏中高表达，在脑、肺脏、直肠和性腺等组织中低表达[9,18]，编码跨膜型Klotho蛋白；人的Klotho基因主要表达于肾脏，在胎盘、前列腺和小肠等组织中低表达，主要编码分泌型Klotho蛋白[14,17]。Hsu等[19]在对小鼠上皮细胞的研究中发现，白藜芦醇处理细胞中Klotho基因和蛋白呈剂量和时间依赖性显著增加；Mizuno等[20]利用离体试验中研究了甲状腺激素对KlothomRNA表达的影响，发现甲状腺激素可呈剂量和时间依赖性显著增加3T3-L1脂肪细胞中跨膜型KlothomRNA的表达水平，而分泌型KlothomRNA的表达水平有上升趋势但不显著；此外，在成纤维细胞生长因子2(FGF2)转基因小鼠肾脏中，KlothomRNA和蛋白表达水平显著增加，预示着FGF2过表达可能增加Klotho基因和蛋白的表达[21]。

2 Klotho蛋白对氧化应激的影响

二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)氧化，产生红色荧光。Wang等[22]通过构建含Klotho基因的质粒并转染入大鼠主动脉平滑肌(RASM)细胞中使Klotho基因在细胞中得到表达，并通过DHE氧化来评估RASM细胞中超氧化物的产生，结果发现转基因组细胞内超氧化物的水平显著低于对照组；他们还用血管紧张素Ⅱ诱导细胞超氧化物的产生，结果发现转基因组细胞内超氧化物的水平同样显著低于对照组。由此可见，Klotho蛋白可降低细胞内超氧化物水平，进而缓解细胞氧化应激。

机体在有氧代谢过程中产生一系列ROS，对大多数细胞具有毒性作用，当机体内ROS的产生和ROS的清除失衡时，就会出现氧化应激。Song等[23]分别用异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)、ISO与Klotho蛋白刺激H9c2心肌细胞，并用7′-二氯荧光素(7′-dichlorofluorescein，DCF)荧光强度表示细胞中ROS水平，其通过流式细胞仪测量，结果发现：与对照组相比，ISO组DCF荧光强度显著升高，Klotho蛋白组显著降低ISO诱导的荧光强度的升高；他们还分别给小鼠注射ISO、ISO与Klotho蛋白，并用DHE ROS检测法检测小鼠心脏ROS的产生，结果与心肌细胞的结果相同，Klotho蛋白显著降低ROS的产生。因此，Klotho蛋白可以显著降低ROS的产生，进而减缓细胞或机体的氧化应激。

Yamamoto等[4]通过试验证明Klotho蛋白可以抵抗氧化应激：百草枯是一种可以产生超氧化物的化学物质，在Hela细胞中添加百草枯并用荧光探针检测脂质氧化程度，发现添加Klotho蛋白的细胞中脂质氧化程度降低；给Klotho转基因小鼠注射致死剂量的百草枯后发现野生型小鼠的存活率显著低于转基因小鼠；尿8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是体内DNA氧化损伤的生物学标志，研究发现Klotho转基因小鼠的尿8-OHdG含量显著低于野生型小鼠。因此，无论是体内试验还是体外试验，都证明Klotho蛋白可以增加机体对氧化应激的抵抗。

锰超氧化物歧化酶(MnSOD或SOD2)可以清除超氧阴离子自由基(O2-·)，提高机体抗氧化能力。他克莫司(tacrolimus，Tac)可诱导氧化应激，用免疫荧光检测法检测小鼠肾脏中SOD2的表达量，发现Tac处理显著降低了小鼠肾小管细胞线粒体SOD2的表达量，且这种作用被Klotho蛋白显著抑制[24]。因此，Klotho蛋白可上调SOD2的表达，增强其清除有害自由基的能力，从而保护细胞免受氧化应激的损伤。大量研究表明，氧化应激可诱导细胞凋亡的发生，相反，通过检测凋亡基因的表达可以反映出机体的氧化应激状态。进一步的研究发现，Klotho蛋白抑制了Tac诱导的抑凋亡基因Bcl-2的表达；通过Tac处理后，促凋亡标志物Bax、半胱天冬酶9(Caspase-9)和半胱天冬酶3(Caspase-3)的表达量显著增加，且它们在Klotho蛋白处理的细胞中显著降低[24]。因此，Klotho蛋白可通过调控抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡标志物Bax、Caspase-9和Caspase-3的表达来调控细胞凋亡的进程，进而反映氧化应激的状态。

3 Klotho蛋白调控氧化应激的可能机制

3.1 通过激活叉头状转录因子O(FoxO)

叉头状转录因子(Fox)基因即Forkhead，广泛存在于从酵母到哺乳类真核生物中，其源于果蝇的“叉头”突变，目前已发现的Fox基因都具有Forkhead保守区。FoxO是胰岛素(INS)/胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号通路中重要的信号分子，对下游靶基因的表达起到负调控的作用。那么，FoxO与氧化应激之间是怎样的关系呢？已知4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen，4-OHT)具有激活转录因子FoxO3a的作用，Kops等[25]用过氧化氢(H2O2)处理DL23静止细胞50 min后发现，经4-OHT处理过的细胞的氧化程度(ROS水平)较低；而在癌细胞DLD-1中发现，其氧化程度(ROS水平)非常高，该结果说明细胞内氧化程度(ROS水平)的降低可通过激活FoxO3a来实现。Kops等[25]进一步研究了经过4-OHT处理的DL23细胞中SOD2 mRNA和蛋白的表达水平，结果发现SOD2的mRNA和蛋白表达水平随着时间的推移而增加。由此可见，FoxO可通过提高SOD2的表达水平、降低细胞内ROS水平而抑制氧化应激，那么如何激活FoxOs则是至关重要的。

Klotho蛋白可通过降低FoxO的磷酸化，促进其向细胞核转移来激活FoxO，也可提高FoxO的转录活性并促进其下游靶基因SOD2的表达。Yamamoto等[4]用Klotho蛋白刺激Hela细胞，观察到该蛋白以剂量依赖的方式降低了丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)和FoxO1磷酸化的基础水平；蛋白质微阵列分析表明Klotho蛋白抑制了Akt和FoxO1的基础磷酸化水平和胰岛素诱导的Akt和FoxO1的磷酸化水平，同样也抑制了FoxO3a和FoxO4的磷酸化水平；此外，他们还用免疫组织化学分析检测了Klotho蛋白诱导的FoxO磷酸化下降是否与其核转位相关，结果表明Klotho蛋白促进FoxO1从细胞质转移到细胞核；同时，免疫印迹分析证实，Klotho蛋白以剂量依赖的方式显著增加核内的FoxO1水平。这些观察结果表明Klotho蛋白信号可引起FoxO的核转位。Yamamoto等[4]通过使用含有3个典型的FoxO结合位点的荧光素酶报告基因(FHRE-Luc)和含有人SOD2基因启动子的SOD2-Luc来测量FoxO的转录活性，将其转染到Hela细胞后发现Klotho蛋白显著增加了报告基因和SOD2基因启动子的表达；染色质免疫共沉淀试验(ChIP)被用来确定转录因子FoxO1是否结合到SOD2的启动子，结果表明Klotho蛋白处理显著增加了与SOD2基因启动子结合的FoxO1的量且Klotho蛋白可促进SOD2基因的表达。综上所述，Klotho蛋白可激活FoxO，其具体途径如下。

3.1.1 Klotho蛋白通过抑制INS/IGF-1信号通路激活FoxO

脊椎动物FoxO亚家族成员可进一步分为FoxO1、FoxO3a和FoxO4，INS/IGF-1信号通路对其具有负调控的作用，具体途径见图1[26]。INS/IGF-1信号通路引起Akt的磷酸化和激活并导致FoxO的磷酸化，磷酸化的FoxO从细胞核中移除且失活。因此，如何抑制INS/IGF-1的信号通路是问题的关键。Kurosu等[6]用免疫沉淀和免疫印迹的方法研究了Klotho蛋白对细胞内INS/IGF-1信号通路的影响，结果发现Klotho蛋白对该信号通路具有抑制作用。因此，Klotho蛋白可通过抑制INS/IGF-1信号通路激活FoxO。

3.1.2 Klotho蛋白通过抑制p53/p21信号通路提高FoxO的转录活性

P21基因是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，它可以和p53共同构成细胞周期G1检查站，减少损伤DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用[27]。Miyaguchi等[28]在COS-7细胞的研究中发现p53与FoxO3a之间可以相互作用。由于蛋白与蛋白之间的相互作用会影响FoxO的转录活性，因此有必要了解p53和FoxO在细胞内结合是否影响FoxO的转录活性。进一步的研究发现：p53抑制FoxO3a的转录活性，而FoxO3a不影响p53。氧化应激与许多病理生理过程关系密切，是细胞衰老的一个重要诱因。Ikushima等[29]研究了Klotho蛋白是否可以减少过氧化氢诱导的人脐血管内皮细胞(HUVEC)衰老以及p53、p21的表达，结果表明Klotho蛋白处理的细胞衰老减弱且p53、p21的表达降低。因此，Klotho蛋白可通过抑制p53/p21信号通路进而提高FoxO的转录活性。

Insulin：胰岛素；IGF-1：胰岛素样生长因子-1 insulin-like growth factor-1；receptor：受体；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；FoxO：叉头状转录因子O Forkhead box O；SOD2：锰超氧化物歧化酶 manganese superoxide dismutase；Catalase：过氧化氢酶。

图1Klotho蛋白与INS/IGF-1信号通路的关系示意图

Fig.1 Schematic diagram of the relationship between Klotho protein and INS/IGF-1 signaling pathway[26]

3.1.3 Klotho蛋白通过负调控磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路提高FoxO的转录活性

FoxO是PI3K/AKT信号通路的下游转录因子，用以调控相应靶基因的表达，途径见图2[30]。Sun等[24]使用HK-2细胞全细胞裂解物的免疫印迹分析，结果显示Tac处理激活PI3K/AKT信号通路，从而增加FoxO3a的磷酸化(导致失活或保留在细胞质)和SOD2表达的降低，而Klotho蛋白处理后可降低FoxO3a的磷酸化且SOD2的表达升高。

综上所述，Klotho蛋白可通过抑制INS/IGF-1、p53/p21、PI3K/AKT信号通路来激活FoxO，降低ROS的产生，促进抗氧化靶基因的表达，从而缓解氧化应激。

3.2 Klotho通过激活环磷酸腺苷(cAMP)信号通路调节NADPH氧化酶(Nox)2蛋白的表达

最近的研究表明，Nox是脉管系统中ROS的主要来源[31]，Nox2(gp91phox)及其同系物(Nox1、Nox4和Nox5)是Nox的催化亚基。Wang等[22]研究表明，Klotho基因转移降低了大鼠主动脉平滑肌细胞中Nox2蛋白的表达，从而降低细胞内氧化应激水平。Wang等[22]研究还发现Klotho基因转移可剂量依赖性地增加大鼠主动脉平滑肌细胞内cAMP的水平和蛋白激酶A(PKA)的活性，降低Nox2蛋白的表达；而加入cAMP抑制剂后，PKA的活性降低，Nox2蛋白的表达升高。因此，Klotho蛋白通过cAMP/PKA信号途径降低Nox2蛋白的表达。

Growth factor：生长因子；receptor：受体；PI3K：磷酯酰肌醇3-激酶 phosphoinositide 3-kinase；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；FoxO：叉头状转录因子O Forkhead box O；○P：磷酸化 phosphorylation；ROS detox. 活性氧去除 reactive oxygen species detoxification；SOD2：锰超氧化物歧化酶 manganese superoxide dismutase；Catalase：过氧化氢酶；Nucleus：细胞核。

图2Klotho蛋白通过PI3K-AKT信号通路调控FoxO示意图

Fig.2 Schematic diagram of regulation of Klotho protein on FoxO by the PI3K-AKT signaling pathway[30]

3.3 Klotho通过激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路发挥抗氧化作用

Keap1-Nrf2信号通路是细胞内重要的抗氧化通路之一。据报道，Klotho基因的过表达可导致核Nrf2的增加和ARE的活化[32]，而ARE可调控血红素氧合酶1(HO-1)和过氧化物酶-1(Prx-1)的启动子区域。血红素氧合酶(HO)和过氧化物酶(Prx)都是一种广泛存在的抗氧化酶，在机体抗氧化过程中发挥重要作用[33]。Maltese等[34]研究了Klotho是否有增强人主动脉平滑肌细胞的抗氧化防御作用，结果表明，Klotho蛋白以剂量依赖的方式显著增加Nrf2、HO-1和Prx-1的表达；此外，用沉默RNA(siRNA)敲减Nrf2后显著减弱了Nrf2、HO-1和Prx-1的表达。

4 小 结

Klotho基因在动物体内呈多组织表达特性，它主要调节机体的抗衰老、抗氧化能力。本文综述了Klotho蛋白对氧化应激的作用及调节机体抗氧化应激的可能分子机制，其作用机理涉及到FoxO、cAMP信号通路以及Keap1-Nrf2/ARE信号通路。氧化应激可造成动物生产过程中的巨大损失，而Klotho蛋白的发现及探究其作用机理可为开发新型抗氧化剂、抗炎剂提供理论基础，是否可以通过开发Klotho蛋白的过表达产品来缓解动物氧化应激、动物对Klotho蛋白是否可以消化吸收还有待深入的研究。此外，有必要进一步研究Klotho蛋白在信号转导过程中的作用，进而通过调控Klotho基因表达来对衰老及衰老相关疾病提供新的治疗方法。