CTLA-4基因多态性与乙肝相关性肝硬化患者肝移植术后复发的关联性分析

颜 敏， 瞿 新

湖北医药学院附属人民医院检验科，湖北 十堰 442000

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球严峻公共卫生问题，调查显示，我国乙肝表面抗原(HBsAg)阳性率超过5%，且HBV感染是导致肝炎、肝硬化及肝癌的主要原因，约75%的肝硬化均与HBV感染有关[1]。肝移植术是目前治疗乙肝相关性终末期肝病的主要方案，但术后移植成功率较低，复发风险大，且HBV复发及再感染是引起乙肝相关性肝硬化患者肝移植术后死亡的主要原因[2]。但目前尚未明确乙肝相关性肝硬化肝移植术后复发的确切机制，既往研究[3]多认为与抗病毒治疗有关，近年来发现免疫机制与肝病复发有相关性[4]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)系免疫球蛋白超基因家族成员，与CD28同源性较高，常以二聚体形式表达于T细胞表面，对T细胞增殖及免疫反应均有负向调节作用。B7-CTLA-4通路共刺激信号的变化与自身免疫相关性疾病发病存在紧密联系，CTLA-4与B7结合可抑制T细胞活化，降低机体对恶性肿瘤的免疫能力，导致疾病进展。CTLA-4基因存在多个遗传多态性位点，决定了个体免疫强度的差异性，早期已有研究[5]证实，CTLA-4基因多态性与糖尿病、甲状腺疾病、系统性红斑狼疮等疾病发病有关，但对乙肝相关性肝硬化患者肝移植术后复发与CTLA-4基因多态性的关系尚少见报道。基于此，为探讨CTLA-4基因多态性与乙肝相关性肝硬化患者肝移植术后复发的关系，现对收治的46例患者的临床资料进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2007年1月至2014年2月于我院接受肝移植术治疗的46例乙肝相关性肝硬化患者的临床资料。男29例，女17例，年龄(51.6±5.7)岁(20～76岁)。纳入标准：均符合中华医学会肝病学分会慢性乙型肝炎防治指南中乙肝相关性肝硬化诊断标准[6]；乙肝五项中HBsAg阳性，或HBsAg阴性但HBV-DNA阳性或有明确乙型肝炎病史；伴明显肝功能损伤表现；影像学证实存在肝硬化征象；完成肝移植治疗，术前均留取外周血标本，术中留取肝脏组织标本，且临床及随访资料完整。排除标准：其他原因所致肝硬化者；习惯性饮酒史者；血吸虫感染病史者；合并严重心脑血管疾病者；合并精神疾病者；合并其他系统恶性肿瘤者；临床及随访资料不完善者。本组所有患者在肝移植前后均接受拉夫米定+乙肝免疫球蛋白治疗，术后均采用免疫抑制剂治疗，术后确诊乙肝复发患者均接受高效价乙肝免疫球蛋白治疗方案。

1.2乙肝复发诊断标准(1)术后HBsAg阳性；(2)术后血清HBV DNA阳性；(3)术后肝组织活检HBsAg阳性；(4)术后肝组织活检HBV DNA阳性；满足上述之一均可确诊。

1.3主要仪器与试剂DNA抽提试剂盒(德国凯杰公司)，Taq酶系统(北京天根公司)，CTLA-4引物设计及合成(上海生工生物有限公司)，限制性内切酶、10×缓冲液(美国MBI公司)，Ficoll分离液(上海生工生物有限公司)，DNA Marker(大连Takara公司)，琼脂糖(上海Promega公司)，dNTP(上海Sangon公司)。全自动377型DNA测序仪(美国应用生物系统公司)，Mastercycler gradient DNA扩增仪、微量加样器(德国Eppendorf公司)，PT 200DNA自动扩增仪(美国MJ Research公司)，紫外分光光度计(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)，台式高速冷冻离心机(上海离心机械研究所)，电子天平(日本SHIMADZU公司)，微波炉(广东格兰仕公司)，超低温冰箱(日本SANYO公司)，恒温循环水浴箱(丹麦Heto公司)。

1.4方法CTLA-4基因多态性检测：采用DNA抽提试剂盒提取外周血DNA，200 μl缓冲液洗涤，重悬全血，分离单个核细胞，加蛋白酶K(质量浓度为200 g/L)20 μl，加入Buffer AL 200 μl，震荡15 s，56 ℃水浴10 min，室温冷却，加无水乙醇200 μl，振荡15 s，移至过滤柱，离心(14 000 r/min)60 s，离心半径(r)=10 cm，弃滤过液。取冻存肝组织标本20 mg，碾成粉末，溶解，加入蛋白酶K 15 μl消化，十二烷基硫酸钠(SDS，质量浓度为100 g/L)75 μl，搅拌均匀，呈黏稠状，50 ℃水浴保温，过夜，充分裂解，消化蛋白，室温冷却，加入等体积酚/氯混合溶液，混合均匀，直至呈乳状，4 ℃离心10 min，吸取上清，加入750 μl异丙醇，室温摇动均匀，DNA沉淀后，离心10 min，弃上清，加乙醇漂洗2次，离心，弃上清，加水重新溶解DNA，沉淀量少时加乙酸钠溶液，测定样本DNA浓度，满足要求后进行聚合酶联(PCR)反应，引物设计参照文献[7]，上游：5′-ATTGGGATTTAGGAGGACC-3′，下游：5′-AATACAGAGCCAGCCAAGCC-3′。反应体系：10×Buffer 5 μl+镁离子25 mmol/L 4 μl+脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)10 mmol/L 2 μl+上下游引物各2 μl+基因组DNA 4 μl+Taq聚合酶0.6 μl+双蒸水30.4 μl，总反应体积50 μl，反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 5 s，72 ℃ 45 s，32个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，扩增DNA。采用限制性片段长度多态性分析法(RELP)检测CLTA-4基因型，先进行限制性内切酶酶切反应，总体积20 μl，37 ℃水浴3 h，65 ℃酶灭活20 min，聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳，DNA银染，采用直接测序法应用全自动DNA测序仪测定CTLA-4基因型。

1.5统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有样本均进行Hardy-Weinberg遗传平衡性检验，单个基因型与组间等位基因频率比较采用四格表χ2检验或Fisher确切概率检验，计量资料采用t检验，基因多态性与乙肝复发风险采用Logistic回归模型进行分析，记录OR与95%CI，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1乙肝相关性肝硬化患者肝移植术后复发情况乙肝相关性肝硬化46例，肝移植术后均随访(24.12±2.47)个月；其中9例复发，复发率为19.57%，复发时间(8.41±1.6)个月。

2.2复发患者与未复发患者基线情况比较复发患者性别、年龄、免疫抑制治疗方案对比，差异无统计学意义(P>0.05)，但复发患者术前HBV DNA浓度及术后HBsAb滴度均低于未复发患者，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 复发患者与未复发患者基线情况比较Tab 1 Comparison of baseline conditions between recurrence and non-recurrent patients

注：HBsAb为乙型肝炎表面抗体。

2.3复发患者与未复发患者CTLA-4外显子49G/A基因型分布各样本经检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，数据有其代表性，肝移植术后乙肝复发患者其CTLA-4+49位点携带AA型、C、A型基因频率(75.00%)高于未复发患者(50.00%)，差异有统计学意义(χ2=9.555，P<0.05)，复发患者G、A等位基因出现频率低于未复发患者，但差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2 复发与未复发患者CTLA-4外显子49 G/A基因型分布Tab 2 Distribution of CTLA-4 exon 49 G/A genotype in recurrence and non-recurrent patients 比例/%

2.4复发患者与未复发患者CTLA-4启动子1661A/G基因型分布复发患者携带AG+GG基因频率(55.56%)高于未复发患者(13.51%)，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

2.5乙肝相关性肝硬化肝移植术后复发的相关因素分析术后HBsAb滴度、携带GA基因型、携带AG+GG基因型均与乙肝相关性肝硬化肝移植术后复发有关(P<0.05)，CTLA-4+49位点携带GA基因型患者其复发风险为携带其他分型患者的3.041倍，CTLA-4启动子1661位点携带AG+GG基因型患者其复发风险为携带AA分型患者的2.126倍，术后HBsAb滴度较低的患者其复发风险为高滴度患者的2.178倍(见表4)。

3 讨论

CTLA-4基因为T细胞表面的重要激活分子，常表达于激活T细胞表面，以二聚体形式存在，可与抗原递呈细胞(APC)表面B7分子相结合，协同产生作用，抑制T细胞活化及增生。原始T细胞活化主要依靠CD28、CD80、CD86 B7家族分子相结合发挥共刺激作用，而CTLA-4基因对B7家族亲和力较CD28高，为其关键竞争性拮抗剂，其可通过与B7分子结合，抑制白介素-2(IL-2)产生，改变T淋巴细胞活化周期。周双男等[8]表示，B7-CTLA-4通路共刺激信号的变化与自身免疫性疾病的发病存在重要关联。CAO等[9]指出，自发性及治疗诱导移植物耐受等均与CTLA-4信号通路存在一定的联系。且有研究[10]发现，CTLA-4基因多态性可影响T细胞抗肿瘤免疫能力。CTLA-4分子基因存在多个遗传多态性位点，在决定机体免疫强度差异上有重要作用。目前已被证实，共刺激通路CTLA-4基因遗传多态性与自身免疫性肝炎、系统性红斑狼疮、白斑病、重症肌无力、移植后排斥反应等病理及生理过程均密切相关[11]。ZHANG等[12]从遗传免疫学方面对乙肝发生病理过程进行研究，发现CTLA-4基因遗传多态性与特定人群乙肝易感性有关。

表4 乙肝相关性肝硬化肝移植术后复发的相关因素分析Tab 4 Analysis of related factors of recurrence after liver transplantation for hepatitis B-associated cirrhosis

乙型肝炎系HBV病毒感染所诱导的病理性免疫损伤，体内乙型肝炎病毒的清除主要依靠T淋巴细胞进行调节，CTLA4基因缺陷，影响机体对HBV清除能力，减弱其对免疫反应的负向调节，可能增加肝炎的易感性。目前发现CTLA-4基因存在6个多态性位点，其中外显子1第17密码子49位点A/G二态性及启动子-1661 A/G二态性与自身免疫性疾病关系的研究较多[13]。CTLA-4外显子1区编码T细胞膜表面成熟CTLA-4+49位点A等位基因为野生型，易突变形成G等位基因，外显子第17密码子编码的氨基转为丙氨酸，导致蛋白极性发生改变，降低T细胞对CTLA-4分子蛋白的合成能力，影响T淋巴细胞免疫功能。HUANG等[14]发现，携带CTLA-4+49位点GG基因型者HBV特异性免疫功能较强，感染HBV风险低于携带该位点其他基因型者。也有研究[15]指出，携带CTLA-4+49位点GG基因型乙肝患者在HBV急性感染性更易恢复。此外，CTLA-4+49位点遗传多态性对肝移植术后受体内移植物特异性T细胞免疫强度同样有其一定程度的影响。KENNEDY等[16]对肝移植患者移植物进行病理活检发现其存在与乙肝患者HBV特异性类似的CD4+T淋巴细胞增殖表现，考虑到CTLA-4遗传基因多态性可能通过改变乙肝患者HBV特异性免疫强度导致移植术后乙肝复发。CTLA-4+49位点携带GG型乙肝相关性肝硬化患者其调节性T细胞表面CTAL-4分子表达水平低，CD4+T细胞活性上调且数量上升，可强化HBV细胞免疫，减少复发风险。

本研究共纳入46例乙肝相关性肝硬化肝移植术后患者，随访发现9例复发，复发率为19.57%，与早期研究[17]报道的10%～18%相近。并对患者CTLA-4外显子1第17密码子49位点A/G及启动子-1661 A/G基因多态性进行检测发现，移植术后乙肝复发患者其CTLA-4+49位点携带AA型基因频率高于未复发患者，其1661位点携带AG+GG基因频率高于未复发患者，而其+49位点携带GG基因所占比例较未复发者低，与上述结论相符，主要可能与携带CTLA-4+49位点AA型基因患者其体内调节性T细胞表面CTLA-4分子功能缺陷，影响术后机体对HBV特异性细胞免疫作用，可能增加乙肝复发风险。同时1661位点携带AG+GG基因型患者其复发风险较携带AA基因频率患者低，提示CTLA-4 1661位点基因突变可能参与乙肝相关性肝硬化患者肝移植术后复发的病理过程，而+49位点GG型基因可能为受体乙肝复发的重要保护型等位基因，但对其确切机制尚待进一步证实。此外，本研究还发现，术后HBsAb滴度与移植术后患者乙肝复发有关，与HALAZUN等[18]研究结论相同。但本研究纳入病例数量有限，且随访时间尚短，后续需扩充病例，延长随访时间，进一步对其分子学机制进行研究。

综上所述，乙肝相关性肝硬化患者肝移植术后复发与术后HBsAb滴度、CTLA-4+49位点及1661位点基因多态性有关，其可能通过影响机体免疫调控参与乙肝术后复发过程，但对其确切分子学机制尚待深入研究证实。