土壤团聚体微结构研究方法及进展

唐 茹，孙钰翔，戴 齐，林清美，谢丽华

(湖南农业大学 资源环境学院，湖南 长沙 410128)

土壤团聚体作为土壤的重要组成部分，被广泛认为是土壤结构的基本单元和重要参数。国内外学者对土壤团聚体的数量、分布、稳定性及其影响因素进行了研究[1-2]，然而这类研究均不能描述土壤团聚体内部结构、解释团聚体形成过程及机制[3]，而且团聚体的基本物理指标包含的信息非常有限，无法体现团聚体复杂的内部结构差异，难以区分和判别各类土壤团聚体形状和内部孔隙特征[4]。随着土壤形态学研究的深入，对土壤团聚体结构的研究已从显微镜、电子显微镜和扫描电镜的镜下定性观察发展至医用CT、工业CT、同步辐射显微CT结合图像处理技术的定量分析。将得到的定性、定量微结构数据与团聚体内部各种养分、微生物、胶结物质等数据融合分析，是解释团聚体状态及形成机制的理想途径[5]。土壤团聚体微结构研究已在农业生产、土地利用、全球环境保护等方面取得大量研究成果[6-7]。综述了土壤团聚体微结构的研究尺度，土壤团聚体的采集、制备方法及土壤团聚体微结构的分析方法和数字图像处理技术，阐述了土壤团聚体微结构在水土保持、土壤侵蚀、生态修复、土地利用、农业生产、建筑工程、环境保护、土壤系统分类等领域的研究进展，并对其研究前景进行了展望，以期为土壤团聚体微结构研究提供参考。

1 土壤团聚体微结构研究尺度

土壤团聚体是土粒经过凝聚胶结作用形成的直径<10 mm的良好结构体，通常以0.25 mm为界，将其分为微团聚体和大团聚体。近年来，对团聚体的研究从稳定性指标的测定转向微结构分析。土壤团聚体微结构研究尺度受多种因素影响，选择合适的团聚体粒径尺度是科学研究土壤团聚体微结构的第一步，也是探明团聚体的形成、稳定和破碎机制及规律的基础。

不同仪器测定样品的尺寸、分辨率、测定条件存在较大差异。例如：光学显微镜分辨率仅达0.1 μm级，而电子显微镜达到纳米级。两者测定的样品尺寸较小且制备繁琐，结构易遭到破坏。而医用CT、工业CT、同步辐射显微CT可直接测定样品，不破坏其原有结构，且有较高的分辨率。就同类仪器而言，样品尺寸越大，分辨率越低，反之亦然。如纳米焦点工业CT，既可测定直径约5 cm、长约10 cm的小土柱，也可测定直径约5 mm的团聚体。经处理后的土柱图像，既能捕捉不同尺寸的团聚体，也能观察到团聚体内部及团聚体间的孔隙，但图像分辨率通常>30 μm,获取的孔隙结构参数可靠性低。然而，团聚体样品的图像分辨率高达10 μm，可获取相对精确的团聚体内部微结构信息。

土壤微团聚体尺度小，测定要求高且结构稳定性差，因此，大团聚体一直是主要的研究对象。一般选择干筛后所占比例最大粒级的团聚体作为研究对象[7-9]。孙经伟等[7]发现，免耕土壤、不施肥耕作土壤和仅施化肥耕作土壤的团聚体组成中皆是3～5 mm 团聚体所占比例最大，基于代表性考虑，就从每个小区随机选取3个3～5 mm 团聚体制片分析土壤团聚体的微结构变化。

2 土壤团聚体微结构研究方法

2.1 土壤团聚体取样方法

因研究目的及观察设备不同，所取土壤团聚体样品一般包括原状土样和混合土样两大类。采集原状土样时，通常将环刀托套在环刀、铝盒或PVC管等工具上，竖直按压进土层，用铲子铲出，削去多余部分用保鲜膜包裹好[10-12]。混合土样常采用土钻取样法、铁铲和竹片采集法等采集[7]。土钻取样法是将表面植物小心去除，将土钻向下按压，采用重锤少击法(保证进钻深度与取样器内取出土段长度一致，锤击次数过多土样会紧实，孔隙度偏小)，多点采集后混合得到混合样(1.5～2.0 kg)，并轻轻置于塑料或铝质容器中[12]。铁铲和竹片采集法与土钻取样法类似，用刀片剥去与工具接触变形的部分。若研究土壤剖面情况时，需划分土壤层次分层采样。值得注意的是应采集湿度适中的土样，并避免样品装样、运输、保存过程中的扰动。

混合土样在室内自然风干过程中应根据土壤的塑性大小，沿着土壤的自然结构轻轻剥成直径约为10 mm的小土块，从而防止因外力作用产生变形，同时剔去粗根和小石块。风干后干筛，获得不同粒径团聚体。需立即测定的原状土样应及时置于冰箱中保存。

2.2 土壤团聚体制样方法

切片法和染色法作为传统的制样方法，通常是将风干后的原状土样用锯条、刀子等工具切成所需尺寸，在不破坏其结构的前提下厚度尽量薄，并根据土壤松散或紧实等具体情况进行固化、切片、磨片、粘载玻片，制成土壤薄片[13-14]。制片方法因土壤固化剂不同而有所差别。初期采用加拿大树脂、松香树脂浸煮方法制片，但该方法固化时间长，且要经过高温处理，土壤结构和物质成分会被破坏，所以无法得到广泛应用[15]。直到20世纪60年代，人们发现合成树脂浸渍剂可以在常温下进行固化，使土壤结构破坏的问题得到解决，但样品固化时间长的弊端仍未解决[16]。目前，普遍采用的环氧树脂-三乙醇胺低温固化—冷杉胶年粘片法和冷杉胶-松节油低温渗胶固化—502 胶粘片法具有保持土壤原状结构和简便易行等优点[17]。此外，可以在浸渍前或加薄片前对样品进行染色，便于清晰地观察到团聚体微结构。常用的染料包括龙胆紫、亚甲基蓝、丽丝胺黄F.F.、罗丹明B等[18]。制好的薄片便可置于镜下观测，获取定量和定性数据。

切片法或染色法都是比较繁琐的制样方法，而使用断层扫描CT、同步辐射显微CT等设备检测时，样品制样简单，无需前处理。如同步辐射显微CT不用制片，仅需将待测团聚体烘干后低温保存，待检测时直接取出团聚体固定在样品台上进行CT扫描，便可快速获取土壤团聚体的三维图像。

2.3 土壤团聚体微结构分析方法

土壤团聚体微结构分析分为定性分析和定量分析2种。早期的定性分析在很大程度上需要借助经验进行，学者们通过观察工具获得直观的团聚体图像，但其结果通常具有不确定性，误差较大。随着观察技术和图像处理技术的改进，获取土壤团聚体微结构的定量数据成为发展的要求。目前，观察土壤团聚体微结构的主要设备有光学显微镜、电子显微镜、X射线计算机断层显微CT、同步辐射X射线显微CT。

2.3.1 基于光学显微镜的分析方法 光学显微镜中的偏光显微镜最早被应用于观察土壤微观结构。初期研究者通过镜下九宫格观察，定性描述了土壤团聚体的三维方向和土壤团聚体孔隙的大小、分布等情况。Hoshino[19]通过反偏光显微镜半定性地描述了放牧和耕地土壤的团聚体分布和孔隙大小情况；Lafeber[20]通过偏光显微镜技术观察，确定了板状黏土矿物和矿物团聚体的三维方向；孙经伟等[7]通过偏光显微镜发现，投入有机物料的耕作土和黑土团聚体呈海绵状微结构且内部多孔；陈宇龙[21]通过反偏光显微镜观察发现，云南弱膨胀土微团聚体排列混乱，团聚体间相嵌较紧密，工程性质相对较好。申思雨等[10]利用偏光显微镜肉眼辨别团聚体的发育和分离程度，发现常规种植条件下的土壤团聚体是弱发育的块状团聚体，无公害种植条件下是轻度分离的团粒结构，有机种植条件下是高度分离的团粒结构。这种肉眼观察团聚体微结构的方法，具有速度慢、精度低、主观性强等局限性。连接光学显微镜的摄影技术可获得更加全面清晰的团聚体微结构特征，它通过调节显微镜放大倍数获得多张团聚体照片或通过图片合成将临近的图片无缝连接。光学显微镜的定性分析到20世纪90年代已基本成熟，半定量化研究也取得初步成果。Chun等[22]利用尼康AZ100体视显微镜结合图像分析技术获得了团聚体孔隙的形态和空间分布特征；Florková等[23]利用新型变焦显微镜和三维图像处理软件获得了同一种团聚体的不同剖面图像，通过多个剖面图像可计算平均算术偏差、均方根、剖面不对称性等指标，以便获取更加准确的团聚体微结构特征。然而光学显微镜受观察原理和分辨率限制，仅限于二维图像的定性和初级的半定量分析。

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2.3.2 基于电子显微镜的分析方法 电子显微镜的分辨率(约0.2 nm)远高于光学显微镜(约200 nm)，已成为获得土壤团聚体信息的便捷工具。电子显微镜主要包括扫描电镜和投射电镜。学者们通过镜下观察，可获取土壤团聚体的孔隙类型及组成、团聚体形貌特征等信息，有助于进一步佐证已有的团聚体形成理论，甚至构建新的团聚体模型。电子显微镜的放大倍数较小，但可呈现团聚体三维立体结构，受到许多研究者的青睐。姚贤良等[24]应用扫描电镜观察到土壤团聚体是由较多的微团聚体垒结而成，在微团聚体内部存在直径小于1 μm的孔隙，在微团聚体间有联结的菌丝体。王志兵等[25]在环境扫描电镜下观察蒋家沟流域泥石流源区土壤发现，团聚体中有3种孔隙：晶粒间孔隙、晶粒内孔隙及穿晶孔隙，并解释团粒间和团粒内的胶结机制，提出团粒内通过胶结物质相互黏聚形成絮凝堆叠结构，团粒间存在桥式胶和架空结构。相对于前述扫描电镜，透射电镜虽无法获取三维结构，却可以看到小于0.2 nm的团聚体内部超微结构。Bailey等[26]利用透射电镜可观察到单个团聚体的超微结构，指出较小的团聚体内部大孔隙较多，因此，较多的小团聚体形成的土壤总孔隙度和孔隙表面积较大。

2.3.3 基于计算机X射线断层显微成像技术的分析方法 计算机X射线断层显微成像技术是利用X射线的穿透能力对物体进行扫描，所得信号经投影等一系列算法得到物体结构的一种成像方法。其作为代表性的医用CT和工业CT技术不仅在医学诊断、工业探伤等领域广泛应用，也为快速获取高分辨率的土壤团聚体三维结构图像信息提供了便利。医用CT测定的样品通常是较大的土柱，但由于其分辨率较低，仅能观察和分析土壤中的大孔隙，会丢失部分信息[27]；工业CT的分辨率较高，测定的样品尺寸范围广。目前，相关研究主要集中于土地利用方式、管理实践方式、母质类型等对土壤团聚体微结构的影响方面。Kravchenko等[28]通过CT扫描发现，土壤团聚体内部大孔隙数量表现为原生演替>免耕>传统耕作，推测这可能是因为免耕和原生演替下的根系通道与团聚体内部的大孔隙形成有关；Naveed等[29]对种植作物的自然土壤团聚体和室内培养过的土壤团聚体分别进行工业CT(X-Tek HMX225)扫描，发现前者的团聚体更加稳固，同时>30 μm的孔隙所占比例可以很好地表征土壤团聚体结构的好坏。由于工业CT技术提高了土壤团聚体微结构特征参数的准确性，许多学者尝试研究了土壤团聚体微结构特征参数与土壤基本理化特性之间的关系。Ananyeva等[30]利用X射线计算机断层显微CT扫描技术获取团聚体内部孔隙大小情况，并与碳的空间分布进行融合分析，发现植被原生演替的土壤团聚体包含较多小孔隙和大孔隙，更加有利于土壤中碳的固定；Mangalassery等[31]利用工业CT扫描不同尺寸的土壤团聚体发现，4～2 mm、2～1 mm、1～0.5 mm和<0.5 mm的团聚体微结构参数均与二氧化碳、甲烷等温室气体的排放有显著关系。

2.3.4 基于同步辐射X射线显微CT的分析方法 同步辐射X射线显微CT作为目前分辨率最高的扫描设备被运用于土壤微形态学研究，可在无前处理条件下对土壤团聚体内部三维结构进行分析，成为近几年的研究热点。有学者[8-9,32-33]基于同步辐射显微CT扫描技术获取了不同利用年限水稻土、不同植被演替过程下红壤、不同施肥处理下老成土和不同施肥措施下红壤性水稻土的团聚体的基本孔隙特征参数，如孔隙数量、体积、长度等；还有部分学者引入形貌参数进一步表征土壤团聚体的不规则性、复杂度、连通性[34-36]。

随着研究的深入,学者们利用同步辐射X射线显微CT的高分辨率和三维成像优势，进一步探讨土壤团聚体微结构定量化参数的影响因素。前人利用同步辐射X射线显微CT发现，孔隙大小、孔喉、孔径长度等孔隙特征均对土壤功能有潜在的影响[37]；对不同土壤利用方式下土壤团聚体进行扫描发现，与草地系统相比，传统耕作系统土壤团聚体含有更多的气体和水分，会阻碍氧气扩散进团聚体，并影响微生物环境和生物地球化学过程，因此，孔容、孔喉比表面积、路径长度等团聚体微结构参数较小[38]；Yu等[39]利用同步辐射X射线显微CT扫描获取2种类型土壤团聚体的定量化参数，并与土壤胶结物质融合分析，结果表明，氧化铁显著影响孔隙大小，在团聚体的形成过程中起到黏结作用，而黏结剂碳对孔隙结构的影响很小。国内同步辐射X射线显微CT研发较晚，经历了第1代、第2代的革新，目前正处于第3代同步辐射X射线显微CT(上海光源)的应用初期。土壤团聚体微结构的研究应用尚处起步阶段，但我国紧随美、日、韩三国步伐，正筹建研发第4代同步辐射X射线显微CT，可为科学研究提供更加优质的技术平台。

2.4 土壤团聚体微结构定量化参数和数字图像处理技术

获得准确的土壤团聚体定量化参数是土壤团聚体微结构研究的关键一步。土壤团聚体微结构定量化参数主要包括基本孔隙特征参数，如土壤团聚体孔隙数量、体积、长度、面积、孔喉和弯曲度等[32-33]，及表征土壤团聚体的形貌参数，如孔隙形状系数、各向异性、欧拉特征值、分形和多重分形等[34-36]。

数字图像处理技术是获取定量化参数的必备技术。其优点是可根据具体情况具体分析、精度高、可获取丰富多样的定量化指标；缺点是信息量大时计算缓慢。图像分割作为数字图像处理技术的重中之重，主要分为手动分割和自动分割。手动分割是通过对比观察，手动为图像设定阈值，耗时但可靠。多人多次的目视分割法[40]就是一种简单有效的手动分割方法，其采用多人次对比原图像、分割图形，直至达到最佳分割效果。自动分割是指选择最合理的分割方法让图像处理软件自行运算，常用的分割方法有二值法、克里克法、Otsu阈值法等。二值法简单易懂，以单一阈值为分界，对图像进行划定，小于阈值划为孔隙，大于阈值划为颗粒。Pal等[41]于1993年提出的单阈值分割图像方法是使用最广泛的二值法，可依据强度、颜色、质地、孔隙等信息的相似性原则确定阈值。然而，当物体呈不规则形状时，阈值的选择存在偏颇性。基于Mardia等[42]的空间阈值算法，Oh和Lindquist开发了普遍优于其他方法的克里克法[43]。该方法首先根据目视自行设置高、低2个阈值，灰度值小于低阈值和大于高阈值的像素分别转化为0和1，灰度值在高、低阈值之间的像素则计算它们同相邻像素间的半方差函数，进而确定其分割值。Otsu阈值算法[44]也可区分土壤孔隙和基质两部分。

3 土壤团聚体微结构研究进展

土壤微形态研究已有近百年的历史，而土壤团聚体微结构的研究不过短短20 a，但在水土保持、土壤侵蚀、土地利用、环境保护、土壤分类等方面研究成果丰硕。

3.1 在水土保持、土壤侵蚀、生态修复领域的研究

土壤是支撑人类社会生存和发展最珍贵的自然资源。通过土壤团聚体微结构研究水土保持、土壤侵蚀等有关的土地问题，取得了显著成果。王志兵等[25]对云南省蒋家沟流域泥区土壤团聚体微结构进行研究，经扫描电镜观察发现，土壤团聚体骨架颗粒之间普遍存在架空结构，胶结物联结强度较弱，从而易发生破坏，为滑坡和泥石流地质灾害的形成机制研究及其防治工作等提供了理论基础。张耀方[47]研究子午岭林区的黄绵土发现，有机碳增加主要改善团聚体间孔隙结构、增加团聚体的有效孔隙，而碳酸钙增加主要增加团聚体贮存孔隙，进一步明确胶结物质对土壤团聚体形成及稳定过程的作用，可为土壤固碳、水土保持提供理论支持及决策依据。王恩姮等[48]模拟冻融研究黑土团聚体结构的前后变化，通过扫描电镜发现，冻融前清晰可见腐殖质与絮片状黏粒物质连成松散的团聚体，冻融后团聚体结构遭到破坏。有研究表明，在众多农田恢复措施中，以耕作、化肥、高有机肥相结合的措施修复土壤速度最快，该措施投入有机物较多，因此，较小的土壤团聚体数量较多，孔隙数量较大且分布均匀，这为了解土壤成土过程和快速恢复土壤肥力提供理论参考[7]。

3.2 在土地利用、农业生产、建筑工程领域的研究

土地利用、农业生产和建筑工程是强烈改变土壤环境的人为活动,会导致土壤及其团聚体结构和稳定性发生变化，长期受到学者的关注。石莹等[49]通过偏光显微镜观察发现，林地较园地和菜地的土壤团聚状况好，旨在对土地开发利用与保护进行指导。Kravchenko等[50]发现，大孔隙所占比例大小依次是原生演替、免耕、传统耕作，推测根系通道可能与大孔隙的形成有关，可见耕作和土地利用方式对土壤团聚体微结构的影响明显。申思雨等[10]研究发现，施用较多有机肥的有机种植模式下的土壤具有较多发育良好的团聚体，且以团粒结构为主，而仅施化肥的常规种植模式下的土壤仅存在弱发育的块状团聚体，有机、无机配施的无公害种植模式下的土壤团聚体介于前两者之间，这进一步从基础理论层面佐证了有机农业的可推广性。李德成等[51]利用数字图像方法发现，免耕下土壤中的团聚体由小变大，孔隙由小变大，土体结构趋于变劣，因此，尚难确定免耕是否有利于改善土壤性质和农业生产。然而自然阶段性降雨不断地改变着免耕土壤团聚体孔隙状况，起到一定的调节作用，为免耕在农业生产中的实际应用提供理论支撑。在农业生产中，赵冬等[52]发现，黄土丘陵区土壤团聚体的分形维数和连通性指标对土壤结构变化的响应相当敏感，可作为该地区植被恢复过程中的土壤质量评价指标，对黄土高原土壤评价具有借鉴意义。李文昭等[9]发现，长期施用化肥会导致土壤团聚体结构退化，而有机、无机肥配施则促进团聚体形成，有效改善土壤结构，具有更好的保水保肥能力，符合可持续性农业生产发展要求。在建筑工程领域方面，最有代表性的研究成果是膨胀土的改进。陈宇龙[21]揭示，膨胀土胀缩的内在原因是膨胀土的基质、团聚体及联结物比较松散的结合，组合间孔隙比较多，导致水分容易渗入与排出。石灰改良膨胀土是经济且效果明显的方法。张小平等[53]研究表明，石灰与较小土壤团聚体更易结合，形成链状微结构，同时石灰掺量主要影响团聚体的表面微结构，使得团聚体之间黏结减弱，不易过量。

3.3 在全球环境保护领域的研究

土壤团聚体微观结构在全球环境保护领域的研究已成为新的研究方向。Zhu等[54]发现，铝土残渣在自然重建过程中土壤团聚体的孔隙度、比表面积、平均路径长度和平均路径曲折度均显著增加，有利于理解自然外力影响颗粒间的相互作用及团聚机制。在全球变暖趋势下，Mangalassery等[31]研究不同的农田管理措施下土壤团聚体微结构与温室气体的关系发现，土壤团聚体孔隙度和孔隙大小对温室气体的排放通量均有显著的影响。大肠杆菌是粪便污染的全球性污染指标之一，Kravchenko等[28]发现，传统耕作处理的土壤团聚体内包含的中等孔隙较多且均匀分布，大肠杆菌也均匀分布，免耕和植被原生演替处理的土壤团聚体内中心位置大孔隙较多，大肠杆菌则集中于外部而未进入团聚体内部，进一步促进了大肠杆菌生存的微观机制研究。Ananyeva等[30]研究耕地和农用地撂荒植被演替土壤团聚体有机碳含量与团聚体内部孔隙分布的关系发现，含较多<15 μm和>100 μm孔隙的植被原生演替土壤团聚体更加有利于土壤中碳的固定。

3.4 在土壤系统分类领域的研究

全球的土壤系统分类正朝着定量化、标准化和国际化方向发展。目前，以诊断层和诊断特性为基础的土壤系统分类已经逐渐完善，但实际的划分过程中，往往遇到难以鉴别的土壤类型，此时土壤团聚体微结构特征也许会给予新的区分特征。土壤团聚体的内部微结构分析有利于阐明土壤属性、形成发生机制和土壤肥力状况。Simas等[55]发现，在南极部分土壤受企鹅活动影响深远，土壤团聚作用良好，氮、磷、碳含量高，植物生物量明显增多。谢萍若等[56]研究不同母质上发育的褐土微团聚体状况、基质微垒结及成土差异发现，黄土发育的褐土的团聚性和稳定性受碳酸钙活动性影响显著，紫色页岩发育的褐土表层有机质含量对形成腐殖质-黏土基质及其团聚作用有特殊意义。

4 展望

4.1 探索土壤团聚体微结构定量化研究新技术、新方法

积极探索土壤团聚体微结构定量化新技术、新方法是推进土壤团聚体微结构研究的不竭动力。土壤团聚体微结构定量化新技术、新方法主要包括：保持样品原有结构的简单制样方法、快速且分辨率高的扫描设备、简单易学功能强大的图像处理软件、具有代表性的定量化参数及模型等。例如，同步辐射X射线显微CT仅可提供高分辨率的土壤团聚体微结构参数，建立三维模型，却无法测定较大样品及获取元素空间分布等额外的信息，所以研发第4代同步辐射X射线显微CT或与电子显微镜、电子探针、能谱仪等设备配合测定并融合分析皆是可行之策；图像分割技术可根据CT图像的灰度值不同区分孔隙和土壤基质，然而至今没有统一的图像分割方法。这需要今后继续探索发现适合多种土壤结构共用的图像分割方法。目前，ImageJ、3DMA-ROCK等图像处理软件已获得了长足发展，但团聚体孔隙的形态及空间分析不足，挖掘更加合适的形态参数以及建立完善的三维可视化模型是未来研究的方向。

4.2 积累土壤团聚体微结构研究成果资料

测定的土壤团聚体微结构数据往往与实际数据存在偏差，并不是简单的线性关系或者叠加关系。周虎等[57]发现，在一定范围内，大孔隙数量均随着研究尺寸增加而增加，这是由于团聚体样品仅包含团聚体内部较小的孔隙，土柱则包含大量团聚体间的大孔隙。因此，土壤团聚体微结构研究离不开大量的研究和验证实例，可以融合不同尺寸样品、不同观察设备获取的团聚体微结构信息，获取更大范围的团聚体孔隙分布数据；也可通过多元数据融合分析进一步确保团聚体微观尺度研究成果的可靠性。

4.3 加强土壤团聚体形成机制研究

近几十年来，土壤团聚体形成理论主要围绕有机、无机复合体对土壤团聚体形成的等级影响方面。实际上土壤胶结物质种类繁多,哪种胶结剂起主要作用、如何作用有待研究。目前，温带土壤团聚体的形成研究已较成熟，而亚热带土壤氧化还原剧烈，往往缺乏合理解释。高分辨率的显微技术代替肉眼为进一步探索亚热带土壤团聚体的形成机制提供了新思路。