甘草与复方五倍子对黄河鲤非特异性免疫力影响的研究

文/韩永峰 吴 桃 贾振荣 薛树平 张丽霞

将复方五倍子和甘草添加到饲料中投喂体重为60g左右的黄河鲤鱼，设5个试验组（复方五倍子组、甘草组、空白组、阳性/阴性对照组）。结果表明，试验期第12天（即投喂药饵后第4天），甘草组的黄河鲤鱼器官免疫指数分别为肾脏0.37±0.02，脾脏0.66±0.02，显著高于阳性对照组。试验期的第12天、16天、20天，碱性磷酸酶活性、溶菌酶活性明显高于阳性对照组。因此，药饵中的复方中药对试验鲤鱼机体免疫器官指数的提高，以及具有免疫功能溶菌酶、碱性磷酸酶活性的增强有一定的作用。

有研究发现，使用添加甘草酸的饲料投喂鲥鱼4周后，以半致死剂量的链球菌攻毒，鱼存活率与甘草酸的投喂量成正相关。不仅如此，甘草对鱼还有调节免疫、抑和灭活病毒、降低转氨酶以及改善肝组织损伤的作用。复方五倍子口服液对鱼类的细菌性疾病防治有较好效果。因此本试验尝试在投喂黄河鲤鱼的饲料中添加甘草与复方五倍子。经检测外周的溶菌酶活性与磷酸酶活性来研究两种药物对黄河鲤鱼的非特异性免疫功能影响，为研究复方中药在提高鱼类机体免疫力等方面提供基础数据。

一、材料和方法

（一）材料

1.试验鱼类

黄河鲤鱼购于达拉特旗大树湾渔业协会，共300尾，体重60g左右，体长12cm左右， 经4%食盐水消毒后分池暂养1周。

2.复方中药的来源及配比

甘草、五倍子、大黄和黄芩主要购于达拉特旗中心医院中药房，药饵的主要成分为五倍子、大黄、甘草，并以质量分数为50%、25%、25%的比例混合配制成复方中药（下文称复方五倍子），再将甘草、复方五倍子粉碎后以质量分数为30%和70%混合，最后以2.0%的添加量加入饲料中，混合均匀后制成2.00mm粒径的饲料（下文称药饵）。

3.饲料

购自天津市某饲料有限责任公司（蛋白质含量为28%）。

（二）方法

1.试验分组及饲养

试验在鄂尔多斯市农畜产品检测中心试验室进行。选择健壮无病的黄河鲤鱼设5个试验组，同时每组设有1个平行组：复方五倍子组、甘草组、空白组、阳性/阴性对照组共10个水族箱，每组饲养60尾黄河鲤鱼。

整个试验周期为20d，试验期的第8d第1次取样，第8d开始投喂药饵，第12d进行第2次取样，第13d进行攻毒试验，第16d进行第3次取样，第20d进行第4次取样。在攻毒后的第4d（试验期的第16d）和第8d（试验期的第20d）测试黄河鲤鱼的各项免疫指标。嗜水气单胞菌0.1mL注射于黄河鲤鱼体内进行攻毒，空白组、阴性对照组用生理盐水（0.86%）替代。攻毒后观察记录各组黄河鲤鱼的症状及死亡数量。然后用统计处理软件进行分析，结果用平均值（X±SD）表示，并进行Duncan’s法比较。

2.嗜水气单胞菌剂

菌液制备：接种于液体培养基中，在28℃的恒温震荡培养箱内培养24h，麦氏比浊法确定浓度，用盐水稀释制备成含菌量1.5×108个/mL的菌液。

3.碱性磷酸酶与溶菌酶的测定

溶菌酶的含量（μg/mL）=[（测定管透光度－对照管透光度）/（标准管透光度－空白管透光度）] ×标准管浓度（10μg/mL）×样本测试前稀释倍数

碱性磷酸酶（金氏单位/100mL）=[（测定管透光度－对照管透光度）/（标准管透光度－空白管透光度）]×100mL×0.05mL

贮备液的配制：取1支（5mg/支）的菌粉，加1mL菌粉溶剂，旋转研磨3分钟后置2℃～8℃冰箱封闭保存1周。

4.采血

在鱼体的尾静脉取血，血液先在室温下静置1h待凝固，于4℃下以4000r/min离心25min，收集上层血清4℃保存备用。

二、试验结果

（一）攻毒对黄河鲤鱼死亡率的影响

攻毒后（试验期第13天），各试验组死亡率最高及时间节点：阳性对照组24h后为12%，甘草组48h后为53%，阳性对照组72h后为 68%。甘草组的死亡率相较于阳性对照组和复方五倍子组明显下降，结果显示，添加甘草和复方五倍子的药饵可以明显减少黄河鲤鱼的患病数量，降低死亡率，对嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症起到了较好的预防与治疗。

（二）免疫器官指数的变化

经统计分析表明（试验结果见表1），第一次取样（试验期第8天）的肝胰脏指数空白组、阳性对照组阴性对照组、复方五倍子组和甘草组之间并没有显著差异（P＞0.05）；第二次取样（试验期第12天，也是投喂药饵后的第4天），即攻毒前1天测定空白组与复方五倍子组的肝胰脏差异显著（P＜0.05），对照组脾脏分别与阴性对照组、复方五倍子组和甘草组差异极显著（P＜0.01），肾脏各组没有显著差异；攻毒后的第4天（试验期的第16天）测定阳性对照组肝胰脏和甘草组差异极显著（P＜0.01），肾脏无显著差异，脾脏也无显著差异；攻毒后第8天（试验期的第20天），经统计分析表明，对照组的肝胰脏与甘草组差异极显著，肾脏无显著差异，但是对照组脾脏与甘草组有显著差异。

表1 免疫器官指数的变化规律

（三）对黄河鲤鱼的碱性磷酸酶活性的影响

在试验期第16天时甘草组的碱性磷酸酶活性显著高于空白组、阳性对照组和复方五倍子组。试验期第12天时甘草组的AKP酶活性有上升趋势，到试验期第16天达到高峰后开始下降。

（四）溶菌酶对黄河鲤鱼非特异性免疫的影响

试验结果表明，试验期第12天甘草组的溶菌酶活性显著高于其他各组。阳性对照组相较于复方五倍子组的溶菌酶的活性要稍微高一些，甘草组在试验期第12天溶菌酶活性最大。

三、分析与讨论

（一）攻毒后黄河鲤鱼的死亡率

试验黄河鲤鱼在攻毒2h后出现死亡，死亡高峰期在48h，病鱼症状呈典型的细菌性败血症症状，表明病鱼因嗜水气单胞菌致死。添加甘草的复方五倍子药饵可以明显降低黄河鲤鱼的患病数量和死亡率，对嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症起到较好的预防与治疗。

（二）对黄河鲤鱼免疫器官指数的影响

鱼的主要免疫器官为脾脏、肾脏和肝胰脏，而脾脏是鱼类机体内最大的外周免疫器官，是产生致敏淋巴细胞和抗体的场所之一。试验结果表明，空白组与阴性对照组、阳性对照组和甘草组相较脾脏指数极显著（P<0.01），阳性对照组的脾脏指数相较于阴性对照组、复方五倍子性组和甘草组极显著（P<0.01）。空白组和甘草组的肾脏指数差异显著（P<0.05），阴性、阳性对照组差异显著（P<0.05），阴性对照组、甘草组差异极显著（P<0.01）。鱼类的肝胰脏是重要的解毒器官，也是重金属蓄积的主要部位，有防御免疫能力，试验中也将肝脏指数作为检验指标之一。如表1阳性对照组相较于阴性对照组、复方五倍子组和甘草组肝脏的指数极显著（P<0.01），甘草组与其他各组无显著差异。

（三）对黄河鲤鱼碱性磷酸酶的影响

碱性磷酸酶是一种非特异性的磷酸水解酶，在生物体内的磷代谢过程中起着十分重要的作用，可催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，在调节鱼类体内钙磷吸收，维持钙磷平衡方面有着重要作用，对于水生动物来讲是重要调控酶类之一。目前我国学者已对多种贝类的AKP进行了研究，就贝类而言AKP不仅维持体内钙磷比例，而且还与贝类角蛋白的分泌相关，同时也作为溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥极其重要的作用。试验中研究表明，复方中药可以提高黄河鲤鱼AKP酶的活性，黄河鲤鱼的AKP酶同样在攻毒后开始呈现下降趋势。

（四）对黄河鲤鱼溶菌酶活性的影响

溶菌酶是鱼类血液中极为重要的一种非特异性免疫因素，居于非特异性免疫的第一道屏障，主要针对于革兰氏阳性菌发挥溶菌作用，其活性的高低直接反映出溶菌作用的强弱，是吞噬细胞对所吞噬的病原菌能否杀灭的物质基础，动物体内许多组织和体液中都含有溶菌酶，血清中的溶菌酶主要来自血细胞中，是一种碱性蛋白，能水解细菌的细胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被释放出来，形成一个水解酶体系从而破坏和消除侵人体内的异物，实现其机体防御的功能。测定鱼类的溶菌酶活性，可以在一定程度上反映鱼类非特异性体液免疫状态。动物血清中的溶菌酶的活性可以因机体接触抗原性物质或者免疫刺激剂而上升。赵明森认为，使用微生态活菌制剂后，4d～5d开始发挥作用，7d～10d效果最好。草鱼体表溶菌酶活性受饲养温度的影响，在10℃下饲养时，溶菌酶活性较低；而28℃下饲养时，溶菌酶活性要高得多。本研究表明在复方五倍子中添加甘草在一定程度上可以提高黄河鲤鱼的溶菌酶的活性。而在攻毒后第8天黄河鲤鱼的溶菌酶活性下降，可能是鱼在感染病毒后，由于其自身的体质下降，导致其溶菌酶活性降低。

试验结果表明，肾脏、肝脏、肝胰脏的免疫力和抗病力都明显增强；同时溶菌酶和碱性磷酸酶的活性也明显提高。因此，中药复方能够增强黄河鲤鱼的免疫能力，可以降低各种病毒病和细菌病的发病率，从而可以给生产增添一种病毒病和细菌病疾病预防方法。