氧化应激对精子损伤的机制及防护

李甜甜 张星颖 李连芹

[摘要] 随着人们工作节奏加快、生活方式改变以及环境污染等因素的影响，不孕不育的发病率呈逐年上升趋势。男性不育的主要原因为精液异常，表现为弱精、少精、无精、畸精症等。男性精子异常的发病机制之一，是上述因素通过抑制机体抗氧化蛋白的活性或者增加活性氧自由基的水平产生氧化应激状态，进而对精子细胞的DNA、脂质、线粒体等产生氧化损伤。对于男性精子异常，除了服用维生素E、维生素C和中草药以外，通过戒除不良嗜好，加上适当的体育锻炼，有助于增强自身的抗氧化能力，改善精子质量。

[关键词] 男性不育症；精子；活性氧自由基；氧化应激

[中图分类号] R321.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（b）-0028-04

[Abstract] The occurrence of infertility is increasing with the rapid mode of work， change of life style and environmental pollution. The main cause of male infertility is abnormal sperms including asthenospermia， oligospermia， azoospermia and sperm malformation. One of the mechanisms that causes abnormal sperms is the increasing of reactive oxygen species level， which results in the oxidative damage on the DNA， lipid and mitochondria of sperms. In addition to the supplement of vitamin E， vitamin C and Chinese herbal medicine， good life habits and proper physical exercises will help to enhance self antionxidant capacity and improve the quality of sperms.

[Key words] Male infertility； Sperm； Reactive oxygen species； Oxidative stress

细胞活动所需要的能源由线粒体提供，而线粒体在提供能源的同时，会产生类似于废气的活性氧簇或称活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。同时，在生物漫长的“演变”过程中，生物体内已经形成了多种抗氧化系统，以清除多余的ROS。正常情况下，自由基的产生与清除保持平衡，使得ROS维持在低剂量状态，作为一种信号分子，参与细胞的增殖、分化、凋亡等生理活动[1]。当机体出现病理状态时，例如在炎症和恶性肿瘤中，所产生的ROS水平超出了抗氧化系统的清除能力，或者当机体的抗氧化能力相对不足时，氧化和抗氧化之间的平衡被打破，就会形成所谓的“氧化应激状态”（oxidative stress，OS）。OS通过影响细胞的信号传导、线粒体的状态稳定等，参与一系列生理病理过程[2]。本文对OS影响精子质量的作用机制及其防护予以综述。

1 OS对精子的损伤机制

精液中的ROS来源于精子、生精细胞和白细胞，其中未成熟精子细胞质滞留所产生的ROS最高[3]。白细胞是精液中ROS的重要来源，其中白细胞异常增高可引起精子细胞的氧化损伤，导致精液的质量下降[4]。前列腺和精囊是精液中白细胞的主要来源，当炎症和感染等各种刺激应答激活白细胞，引起“白细胞反应爆发”时，与正常白细胞相比，能产生高达100倍的ROS[5]。

1.1 ROS对精子细胞膜的损伤

精子膜的功能与其结构密切相关，其质膜富含高浓度的不饱和脂肪酸和双键结构，这些双键是维持精子膜流动性所必需的。精子膜对ROS非常敏感，质膜上的不饱和脂肪酸易受到ROS的攻击，发生脂类过氧化反应，经过脂肪酸的活化、脂酰輔酶A的转移、脂酰辅酶A的氧化以及三羧酸循环等过程，使脂肪酸脱羧基失去双键，进而使精子膜失去流动性，从而影响受精过程中的精卵识别、膜融合、精子与顶体的融合、精子去能等一系列过程，最终导致男性精子功能障碍和男性不育。其中，丙二醛（malonaldehyde，MDA）是不饱和脂肪酸的代谢产物之一，其生成量可反映精子膜的脂类过氧化程度[6-7]

1.2 ROS对精子活动能力等指标的影响

有研究者通过检测男性不育患者的精液参数，得出结论认为：精液氧化应激指数与精子浓度、精子总数、MDA含量、精子DNA碎片化指数成呈相关；与精子活率、前向运动率、低渗肿胀率、快速直线运动浓度、快速直线运动总数、直线速度、路径速度、总抗氧化能力和正常形态率呈负相关[9]。另外，精液的OS可以造成精子膜功能、动态、形态参数的改变以及精子核DNA的损伤，可能是精液OS引起男性不育的重要机制之一[8]。

1.3 ROS对精子DNA的损伤

在精子的发生过程中，生精细胞核中组蛋白逐渐被鱼精蛋白代替。DNA环绕在组蛋白构成的八聚体周围，形成核小体，而鱼精蛋白在DNA的螺旋沟中结合DNA，完全中和DNA，使DNA相邻的两条链通过范得华力结合在一起，从而使精子染色质紧密结合，避免ROS的攻击。然而，在男性不育患者中，ROS与线粒体中DNA碱基反应破坏DNA的完整性，其单链或双链断裂，DNA片段化产生，造成遗传信息改变或缺失。ROS还可通过脂质过氧化作用引起超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，SOD）基因表达变化，从而影响DNA合成，升高核DNA碎片化指数[9]。以上这些ROS的损害作用，均会使男性的精液质量下降，进而造成男性不育的发病率上升。在临床中我们发现，精子染色质异常的患者，其胚胎着床失败率、胚胎流产率和后代发病率均高于染色质正常的患者。有研究认为，大量ROS直接攻击DNA中的鸟嘌呤，或者羟基自由基攻击DNA中脱氧鸟苷上的C-8位形成8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）。目前8-OHdG已成为检测DNA氧化损伤中最常用的生物标志物[10-11]。

1.4 ROS对精子细胞线粒体的损伤

线粒体是为精子细胞提供能量的场所，其通过糖酵解和氧化磷酸化产生“ATP”为精子细胞的活动供应能量。线粒体的结构和功能受到破坏，就会直接影响精子细胞的活力。高水平的ROS可损害线粒体膜，影响电子传递链的功能，引起细胞色素C释放，抑制能量合成，触发细胞凋亡[12]。目前认为，ROS对精子线粒体的损伤机制主要表现在以下方面：①使线粒体膜脂质过氧化，损伤线粒体内膜，影响呼吸链正常传递电子的过程，进而影响ATP的合成[13]。②降低线粒体内与生成ATP有关的酶活性，影响ATP产生[14]。③使线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）发生损伤。mtDNA是线粒体膜的电子传递链上必不可少的一种遗传物质，密切参与线粒体的氧化磷酸化和ATP的生成，因此，mtDNA缺陷将导致线粒体膜电位下降，从而使氧化还原平衡更趋向于OS，最终对精子造成不可逆的伤害[14]。④诱导线粒体内Ca2+释放，降低膜电位，增加内膜通透性，抑制ATP合成，促进细胞的凋亡[15]。精子能量的来源受到损害，精子的活力指数自然也就下降。

2 OS的防护研究

2.1 人体自身的抗氧化物质

保护精子DNA的重要因素是体内抗氧化系统和各种抗氧化剂。总抗氧化能力是指这些酶类和非酶类抗氧化物的总体抗氧化水平，其中SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）等是精浆中含有的可以抵抗这类ROS的重要抗氧化物质[16]。有研究表明，吸烟会导致SOD、谷胱甘肽的活性降低[17]，而适当的体育锻炼可以提高SOD、CAT以及总抗氧化能力的水平[18]，提高抗氧化能力。

2.2 维生素E（vitamin E，VE）

丰富的VE存在于所有的谷类植物中，特別是在种子的胚芽中。VE能清除ROS，是人体最丰富的脂溶性抗氧化剂。VE不仅能促进性激素分泌，而且还参与机体的抗氧化反应，增加男子精子数量和活力。其主要通过限制超氧化物的生成及降低超氧化物水平而发挥抗氧化作用，在细胞抗氧化机制中发挥关键作用。在Tang等[19-20]从VE对苯丙芘诱导雄性大鼠的生殖毒性的保护作用及其机制中得出结论：随着VE剂量增加，精子计数增加，精子畸形率逐渐降低，提示VE对苯丙芘所致生殖毒性有一定的保护作用，几乎可以完全拮抗苯丙芘所产生的慢性生殖毒性作用[21]。

2.3 维生素C（vitamin C，VC）

在低温冷冻时，精子经历了离心、去除精浆、降温冷冻、解冻复温等一系列过程，这些物理和化学效应可致ROS增加，抗氧化物减少，抗氧化酶活性降低[22-23]。而在精液冷冻保护剂中添加一定浓度的抗坏血酸盐、CAT，可以减少冷冻产生的过量ROS，从而减轻后者对精子核DNA的氧化损伤，提高冻融的精子质量[24-25]。Tasdemir等[26]选取30份健康可生育男性精液，并且添加改良后的人精子冷冻保护液。结果发现，含有抗坏血酸盐的保护液其冻融后的a+b级精子与ROS水平存在负相关性，提示抗氧化剂的保护作用可能是通过减少精液冻融过程中产生的ROS而实现的。

2.4 中药抗氧化剂的作用

我们所熟知的一些植物性中药，如菟丝子、黄芪、葛根、人参、柴胡、金银花、川穹、枸杞、车前草等，在动物实验阶段证实对雄性动物的生精有一定的保护作用。这些中药各含有不同的抗氧化剂成分，包括黄酮类化合物、酚酸类化合物、皂苷类化合物、多糖、苯乙醇苷等。黄酮类化合物的抗氧化作用机制主要包括3个方面[27]：①与诱导氧化的过渡金属离子络合；②作用于与ROS有关的酶；③与超氧阴离子反应，阻断ROS引发的连锁反应。酚酸类化合物抗氧化能力的强弱与其结构上的酚羟基有关，当传递出氢原子后自身成为相对稳定的苯氧自由基，从而终止ROS引起的链式反应，通过清除ROS的作用，达到抗氧化作用。通过提高体内SOD、CAT等抗氧化酶的活性，皂苷类化合物能够增强机体抗氧化系统功能。多糖可破坏由ROS产生的DNA分子，抑制脂质氧化，清除ROS。除了能够清除ROS，苯乙醇苷类化合物还能够修复已损伤的DNA。

综上所述，过量的ROS与抗氧化系统损伤均会导致OS，其导致的精子功能障碍的机制是复杂且多方面的。ROS介导的精子质膜过氧化损伤，会导致男性生殖功能的病理性改变。过量的ROS会破坏精子核内DNA的完整性，影响受精率。高浓度的ROS破坏精子线粒体的结构和功能，会加速生殖细胞的凋亡过程，降低精液质量。抗氧化剂主要消除或减弱ROS对精子的刺激，通过阻止自由基链的生成，减少OS造成的损伤。面对当前男性不育所带来的问题，ROS的过量产生所导致的精子氧化应激损伤已受到人们的关注，研究氧化损伤的来源与机制及防护是解决该问题的关键。

[参考文献]

[1] Kuksal N，Chalker J，Mailloux RJ. Progress in understanding the molecular oxygen paradox-function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling [J]. Biol Chem，2017，398（11）：1209-1227.

[2] Mao X，Gu C，Chen D，et al. Oxidative stress-induced diseases and tea polyphenols [J]. Oncotarget，2017，8（46）：81649-81661.

[3] Ollero M，Gil-Guzman E，Lopez MC，et al. Characterization of subsets of human spermatozoa at different stages of maturation：implications in the diagnosis and treatment of male infertility [J]. Hum Reprod，2001，16（9）：1912-1921.

[4] 張俏忻，肖颖秀，程碧珍.白细胞异常增加对精液质量及氧化应激的影响[J].国际检验医学杂志，2016，37（6）：826-727，730.

[5] Dorostghoal M，Kazeminejad SR，Shahbazian N，et al. Oxidative stress status and sperm DNA fragmentation in fertile and infertile men [J]. Andrologia，2017，49（10）：12762.

[6] Moazamian R，Polhemus A，Connaughton H. Oxidative stress and human spermatozoa：diagnostic and functional significance of aldehydes generated as a result of lipid peroxidation [J]. Mol Hum Reprod，2015，21（6）：502-515.

[7] Fraczek M，Hryhorowicz M，Gill K，et al. The effect of bacteriospermia and leukocytospermia on conventional and nonconventional semen parameters in healthy young normozoospermic males [J]. J Reprod Immunol，2016，118：18-27.

[8] Ni K，Steger K，Yang H，et al. A comprehensive investigation of sperm DNA damage and oxidative stress injury in infertile patients with subclinical，normozoospermic，and astheno/oligozoospermic clinical varicocoele [J]. Andrology，2016，4（5）：816-824.

[9] Li J，Barranco I，Tvarijonaviciute A，et al. Seminal plasma antioxidants are directly involved in boar sperm cryotolerance [J]. Theriogenology，2018，107：27-35.

[10] Muratori M，Tamburrino L，Marchiani S，et al. Investigation on the origin of sperm DNA fragmentation：role of apoptosis，immaturity and oxidative stress [J]. Mol Med，2015，21（1）：109-122.

[11] Taken K，Alp HH，Eryilmaz R，et al. Oxidative DNA damage to sperm cells and peripheral blood leukocytes in infertile men [J]. Med Sci Monit，2016，22：4289-4296.

[12] Kaur S，Saluja M，Bansal MP. Bisphenol A induced oxidative stress and apoptosis in mice testes：Modulation by selenium [J]. Andrologia，2017.Doi：10.1111/and.12834.

[13] O'Flaherty C，Matsushita-Fournier D. Reactive oxygen species and protein modifications in spermatozoa [J]. Biol Reprod，2017，97（4）：577-585.

[14] Treulen F，Uribe P，Boguen R，et al. Mitochondrial permeability transition increases reactive oxygen species production and induces DNA fragmentation in human spermatozoa [J]. Hum Reprod，2015，30（4）：767-776.

[15] Amaral A，Loureno B，Marques M，et al. Mitochondria functionality and sperm quality [J]. Reproduction，2013， 46（5）：R163-174.

[16] Dorostghoal M，Kazeminejad SR，Shahbazian N，et al. Oxidative stress status and sperm DNA fragmentation in fertile and infertile men [J]. Andrologia，2017，49（10）：e12762.

[17] Aprioku JS，Ugwu TC. Comparative evaluation of the impact of subacute exposure of smokeless tobacco and tobacco smoke on rat testis [J]. Int J Reprod Med，2015， 2015（1）：676 245.

[18] 蔡文伟，江楠.男性不育患者精液活性氧与精子参数的关系研究[J].预防医学2017，29（3）：264-265，268.

[19] Tang Z，Ding W，Wang L，et al. Protective effect of vitamin E on methyl methanesulfonate-induced teratozoospermia in adult Sprague-Dawley rats [J]. Mol Med Rep，2015，12（3）：4422-4426.

[20] Rezaie AH，Razi M，Amniattalab A，et al. Co-administration of vitamin E and testosterone attenuates the atrazine-induced toxic effects on sperm quality and testes in rats [J]. Cell J，2017，19（2）：292-305.

[21] Adami LNG，Belardin LB，Lima BT，et al. Effect of in vitro vitamin E（alpha-tocopherol）supplementation in human spermatozoon submitted to oxidative stress [J]. Andrologia，2018.Doi：10.1111/and.12959.

[22] Balasuriya A，Serhal P，Doshi A，et al. Processes involved in assisted reproduction technologies significantly increase sperm DNA fragmentation and phosphatidylserine translocation [J]. Andrologia，2014，46（2）：86-97.

[23] Mostek A，Dietrich MA，Sowinska M，et al. Cryopreservation of bull semen is associated with carbonylation of sperm proteins [J]. Theriogenology，2017，92：95-102.

[24] Soleimanzadeh A，Saberivand A. Effect of curcumin on rat sperm morphology after the freeze-thawing process [J]. Vet Res Forum，2013，4（3）：185-189.

[25] Fontoura P，Mello MD，Gallo-Sa P，et al. Leptin improves sperm cryopreservation via antioxidant defense [J]. J Reprod Infertil，2017，18（1）：172-178.

[26] Tasdemir U，Buyukleblebici S，Tuncer PB，et al. Effects of various cryoprotectants on bull sperm quality，DNA integrity and oxidative stress parameters [J]. Cryobiology，2013，66（1）：38-42.

[27] 畢明帅，李俊君，陈帝昂，等.抗氧化类中药对睾丸生精功能的影响研究进展[J].中国男科学杂志，2015，29（8）：59-61.