糖尿病大鼠肠道甜味受体表达及肠促胰素分泌的变化

钱程 冯日露 吴斌 麻静

[摘要] 目的 观察糖尿病大鼠回肠甜味受体（STRs）表达及胃肠激素分泌的变化。 方法 选取健康对照组（CON组）SD大鼠、Zucker肥胖糖尿病大鼠（ZDF组）和链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠（STZ组），每组各7只。三组大鼠均行胃内葡萄糖耐量实验，期间采集血样测量血糖，分离血浆检测胰岛素和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）浓度。1周后，处死大鼠取回肠组织采用RT-PCR检测STRs的表达。 结果 与CON组和STZ组比较，ZDF组回肠T1R3及α-味转导素表达均下调（P < 0.05）。在0、15、30、60、120 min时，STZ组血糖水平高于CON组及ZDF组（P < 0.01）。在0、15、30、60、120 min时，ZDF组血清胰岛素和GLP-1水平高于CON组及STZ组大鼠（P < 0.05，P < 0.01）。 结论 ZDF大鼠回肠T1R3及其下游信号分子表达失调，肠道STRs表达可能与葡萄糖代谢有关，其机制仍需要进一步研究。

[关键词] 糖尿病；回肠；甜味受体；胰高血糖素样肽-1

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（b）-0007-05

[Abstract] Objective To observe the expression of sweet taste receptors （STRs） and downstream molecules in the ileum and gut hormone secretion in diabetic rats. Methods SD rats （CON group）， zucker diabetic fatty （ZDF group） rats and STZ-induced diabetic rats （STZ group） were involved in this study （n = 7）. The rats in each group were received an intragastric glucose tolerance test. Blood samples were taken for measurement of blood glucose， plasma insulin and GLP-1 concentrations. One week later， small intestinal tissue was collected and expression of STRs was detected by RT-PCR. Results T1R3 and α-gustducin in the ileum of ZDF group were down-regulated than those of CON and STZ group （P < 0.05）. Fasting and postprandial glucose concentrations in STZ group were higher than CON and ZDF group at 0， 15， 30， 60， 120 min （P < 0.01）. Fasting and postprandial plasma insulin and GLP-1 levels were higher in ZDF group than CON and STZ group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion The ileum expression of T1R3 and its downstream signaling molecules is disordered in ZDF rats， indicating that the expression of intestinal STRs is related to glucose metabolism. The mechanism underneath it still needs further investigation.

[Key words] Diabetes； Ileum； Sweet taste receptor； Glucagon-like peptide-1

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）由肠道L细胞分泌，L细胞密集分布于回肠。GLP-1受体激动剂如艾塞那肽和利拉鲁肽已经用于临床治疗[1-2]，但是在糖尿病状态下GLP-1分泌的变化，特别是1型糖尿病仍无定论。明确口腔的甜味感受系统至今已数十年[3]，由T1R家族的G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors，GPCR）感知，其中T1R2和T1R3受体异二聚体为主要的STRs。T1R2/T1R3，与α-味转导素（α-gustducin）相结合，然后与受体电位阳离子通道5（transient receptor potential channel，superfamily M，member5，TRPM5）偶联从而发挥作用[4-5]。近期研究显示肠道STRs及下游信号分子与分泌GLP-1的L细胞共表达[6]。本研究旨在观察糖尿病大鼠回肠甜味分子表达以及肠道激素分泌的变化。

1 材料与方法

1.1 试验动物

7周龄健康雄性SD大鼠，体重为300～330 g，SPF级，购自中国科学院上海实验动物中心斯莱克公司，实验动物质量合格证号为SCXK（沪）2007-0005。ZDF大鼠购自北京维通利华实验技术有限公司，实验动物质量合格证号为SCXK（京）2012-0001。在SPF级动物房适应性饲养1周，环境温度20～23℃，湿度40%～60%，每日光照12 h，普通饲料喂养，自由饮水。

1.2 试剂和仪器

饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司）；链脲佐菌素（Sigma公司，批号：S01301）；cDNA逆转录酶试剂盒（TAKARA公司，批号：AK6201）；SYBR Premix Ex TagTM（TAKARA公司，批号：AK8302）；Trizol（Invitrogen公司，批号：39602）；DEPC处理水（上海翊圣生物科技有限公司，批号：D67460）；GLP-1 ELISA试剂盒和胰岛素ELISA试剂盒（Crystal Chem公司）。血糖仪（Roche公司）；低温离心机（Eppendorf公司）；實时荧光定量PCR仪（ROCHE公司）；NanoDrop 2000c超微量分光光度计（Thermo Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的建立及分组 SD大鼠给予普通饲料喂养1周后，尾静脉测定血糖，血糖未见异常，予以大剂量（30 mg/kg）链脲佐菌素腹腔注射，1周后，禁食3 h，血糖>16.7 mmol/L的大鼠视为1型糖尿病模型建模成功，选取7只作为1型糖尿病组（STZ组）。而SD大鼠和ZDF大鼠各7只，分别作为健康对照组（CON组）和2型糖尿病组（ZDF组）。CON组和STZ组大鼠以10%脂肪，22%蛋白质和68%碳水化合物的标准饲料喂养；ZDF组大鼠以16.7%脂肪，26.8%蛋白质和56.5%碳水化合物组成的诱导食物（Purina#5008）喂养。

1.3.2 胃内葡萄糖耐量试验 喂食4周后，三组大鼠年龄12周。禁食16 h后，将每只大鼠进行葡萄糖溶液灌胃（2 g葡萄糖/ kg体质量）。在灌胃前和灌胃后15、30、60、120 min时，用血糖仪测定血糖。在每个时间点从眼窝静脉丛采集血样，每个样品0.5 mL体积，并以3000 r/m离心10 min（离心半径=8.5 cm）。收集血浆用于检测胰岛素和总GLP-1浓度。

1.3.3 酶联免疫吸附试验测定血浆胰岛素浓度和血清总GLP-1浓度 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血浆胰岛素浓度，定量检测批间变异系数为2.77%。用ELISA试剂盒测定大鼠血浆中的总GLP-1浓度，定量检测批间变异系数为4.96%。没有检测到与大鼠NPY、GLP-1（7-36）、GLP-1（1-37）和GLP-2有交叉反应性。操作步骤参照试剂盒说明书操作。

1.3.4 解剖及样本采集 IGGTT 1周后，大鼠腹腔注射水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉后放血处死。腹部切口后，将胃到肛门的整个消化道取出。从小肠中取得回肠段（靠近回盲部1～2 cm）。肠段约300 mg的组织用于实时PCR分析。所有样品都储存在-80℃的组织管中，以便进一步分析。

1.3.5 相对定量实时聚合酶链反应的基因表达（Real-time PCR） 采用酚-氯仿法提取组织内总RNA[7]，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用引物5.0软件设计T1R2、T1R3、TRPM5、α-gustiducin和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的引物，具体序列见表1。使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒于荧光定量PCR扩增仪中进行进行扩增分析。使用2-△△CT方法对目的基因的表达进行计算分析[8]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；重复测量数据采用重复测量方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甜味分子

三组大鼠回肠T1R2 mRNA水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与CON组比较，ZDF组T1R3、α-gustducin和TRPM5表达水平显著降低（P < 0.05）。ZDF组回肠T1R3和α-gustducin的表达水平低于STZ组（P < 0.05）。见图1。

2.2 血糖浓度

在禁食状态下，STZ组血糖水平高于CON组和ZDF组（P < 0.01）。葡萄糖灌胃后，三组大鼠血糖均有升高（t = 15 min），但呈现不同的时间依赖性。在t = 15 min时CON组出现峰值，而STZ组和ZDF组出现在t = 60 min时。在t = 15、30、60、120 min时，STZ组血糖水平显著高于另外两组（P < 0.01）。在t = 30、60、120 min时，ZDF组血糖显著高于CON组（P < 0.01）。见图2。

2.3 血胰岛素浓度

CON组和ZDF组血浆胰岛素水平有组×时间效应（P < 0.05）。ZDF组空腹血浆胰岛素浓度高于CON组和STZ组（P < 0.01）。葡萄糖负荷后，ZDF组及CON组血浆胰岛素明显升高。在t = 15、30、60、120 min时，ZDF组血浆胰岛素水平显著高于CON组和STZ组（P < 0.01）。在t = 15、30、60、120 min时，STZ组血浆胰岛素水平明显低于CON组（P < 0.01）。见图3。

2.4 血GLP-1浓度

血浆GLP-1浓度有显著的组×时间效应（P < 0.01）。ZDF组空腹血清GLP-1浓度显著高于CON组和STZ组（P < 0.01）。葡萄糖负荷后，三组在t = 15 min时血浆GLP-1水平明显增加。在t = 15、30、60、120 min时，ZDF组血浆GLP-1水平显著高于CON组和ZDF组（P < 0.05或P < 0.01）。STZ组与CON组空腹及葡萄糖负荷后血浆GLP-1水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

3 讨论

本研究明确了1型及2型糖尿病大鼠回肠甜味受体表达及GLP-1分泌的变化。两种大鼠回肠甜味受体T1R3、a-gustducin和TRPM5的表达显著减少。1型糖尿病大鼠GLP-1分泌没有降低，2型糖尿病大鼠GLP-1空腹及餐后水平均有增高。

GLP-1受体激动剂广泛运用于临床降血糖治疗，但高血糖对于GLP-1分泌的影响研究结果仍不一致。目前的研究提示2型糖尿病时血清GLP-1存在不变、降低或增加等不同结果[9-15]。ZDF大鼠是具有胰岛素抵抗特点的2型糖尿病动物模型。本研究显示，ZDF大鼠空腹和葡萄糖负荷后，血GLP-1水平显著高于CON组。GLP-1的分泌主要取决于胃排空速度及营养物质在小肠停留时长和部位。据报道ZDF大鼠胃排空速度明显加快[16]，可能与ZDF大鼠餐后GLP-1升高有关。餐后高GLP-1水平也可导致空腹GLP-1高水平[17]。然而，1型糖尿病GLP-1分泌的變化研究不足，在本研究中1型糖尿病大鼠GLP-1分泌并未减少。由此可见，GLP-1受损在1型糖尿病病理机制中作用有限。

尽管甜味信号通路在GLP-1分泌中的作用仍存在争议，但是T1R3或α-gustducin敲除小鼠GLP-1分泌缺失及血糖升高[18-19]。十二指肠甜味受体表达受到肠腔葡萄糖浓度和血糖浓度的调节[20-21]，而这一调节在2型糖尿病患者中受损[20]。本研究在ZDF肠道STRs表达的基础上[21]，进一步探索了STZ大鼠在GLP-1分泌细胞分布较多的回肠甜味受体的表达。禁食状态，ZDF及STZ大鼠回肠T1R3、α-gustducin和TRPM5的表达水平均有下调。既往研究提示，T1R3基因敲除的小鼠会出现胰岛素敏感性减低和葡萄糖耐受不良的情况[22]。由于在葡萄糖灌胃中，取回肠组织有一定的技术难度，虽然未体现进餐过程中回肠甜味受体表达的改变，仍然揭示了1型及2型糖尿病大鼠肠道甜味受体表达及差异。甜味受体在糖代谢异常状态表达改变的机制仍需进一步研究。

本研究显示糖尿病大鼠回肠T1R3及下游信号分子的表达受损，为明确甜味受体及下游信号分子在糖尿病发病机制的作用提供了初步的证据。

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