五指毛桃中补骨脂素提取条件的研究

桂青　周立军　郑定华　潘剑　黄坚雄　袁淑娜　陈俊明　李娟

摘 要 补骨脂素是五指毛桃中的有效成分之一，是很有价值的质量评价指标。本文以超声辅助溶剂提取法提取五指毛桃中的补骨脂素，采用HPLC法对提取液中补骨脂素的含量进行测定，主要研究溶剂类型、料液比、提取温度、提取时间及样品颗粒度等因素对提取效果的影响，确定主要的影响因素及五指毛桃中补骨脂素的提取方法。结果表明：溶剂浓度、温度、时间、颗粒度是影响补骨脂素提取的主要因素。五指毛桃中補骨脂素的提取可采用60%乙醇为溶剂，物料颗粒为70～100目，料液比为1∶10，60℃超声30 min。

关键词 五指毛桃 ；补骨脂素 ；提取 ；影响因素

中图分类号 O652.62 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.06.016

Extraction Conditions for Psoralen from Ficus hirta Vahl.

GUI Qing ZHOU Lijun ZHENG Dinghua PAN Jian

HUANG Jianxiong YUAN Shuna CHEN Junming LI Juan

（Rubber Research Institute， CATAS； Research Center for Utilization of Under-forest Resources； Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture，

P. R. China， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Psoralen is an active component and the most valuable quality assessment indicator in Ficus hirta Vahl.. The psoralen was extracted using organic solvent by ultrasonic-assisted solvent extraction method， and the content of psoralen was determined by HPLC. The possible factors affecting extraction， such as extraction solvent type， sample size， liquid-solid ratio， extraction temperature and time， were analyzed to identify the major factors affecting the extraction and develop an extraction method for psoralen. The results showed that extraction solvent concentration， extraction temperature， extraction time and sample size were the major factors that affected the extraction of psoralen. Psoralen could be extracted from F. hirta Vahl. with 60% ethyl alcohol as solvent， and ultrasonic-assisted for 30 min in a 60 C water bath at the liquid-solid ratio of 1∶10， the granular material size being 70-100 mesh.

Kewords Ficus hirta Vahl. ； psoralen ； extraction ； affecting factors

五指毛桃，别名南芪、五爪龙、五指牛奶，是桑科植物粗叶榕（Ficus hirta Vahl.）的根，是我国华南地区著名的药食两用植物[1]。林励等[2]和魏刚等[3]通过实验证明补骨脂素是五指毛桃的有效成分之一，且为最有价值的质量评价指标。

补骨脂素的提取方法主要有溶剂提取法[4]和超临界CO2萃取法[5]。因超临界萃取需要较高的压力，因此，常用的提取方法仍为溶剂提取法。目前文献报道的五指毛桃中补骨脂素的提取溶剂和方法各不相同，如甲醇冷浸提取法[6]，三氯甲烷水浴回流提取法[7]，乙醇超声提取法[8]，甲醇超声提取法[9]。补骨脂素的测定方法主要有3种，薄层色谱法（TLC）[6]、气象色谱-质谱联用法（GC-MS）[2-3]和高效液相色谱法（HPLC）[7-9]。其中HPLC不仅能定性测定，而且定量测定比TLC和GC-MS更简便快速、结果也更准确，因此，HPLC是目前使用最普遍的测定补骨脂素的方法。

本文以橡胶林下种植的五指毛桃为实验材料，以HPLC为补骨脂素含量测定方法，研究不同提取方式、提取溶剂、提取温度等因素对补骨脂素提取效果的影响，确定补骨脂素的提取工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

五指毛桃于天然橡胶林下种植3 a，采自中国热带农业科学院橡胶研究所实验基地。

1.1.2 试剂

无水乙醇：分析纯，广州化学试剂厂；补骨脂素标准品（纯度≥99.00%），多伦多化学药品研究所，加拿大；Thermo Fisher乙腈（色谱纯），德国；超纯水；其他试剂未作特别说明均为分析纯。

1.1.3 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，美国；P30H超声波清洗器，德国。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

五指毛桃洗净后，经切片、干燥、粉碎后过分样筛。称取样品3.0000 g于三角瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，于超声波清洗器中提取后过滤并定容至50 mL。取2 mL提取液经0.45 μm滤膜过滤后，用于高效液相色谱分析。

1.2.2 影响因素

主要研究溶剂类型、样品颗粒度、料液比、提取温度、提取时间对五指毛桃中补骨脂素提取效果的影响。

1.2.3 高效液相色谱条件

参考王晓平[9]的方法，液相色谱条件略作修改，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国；流动相为水∶乙腈（V：V）=55∶45；流速：1 mL/min；柱温：35℃；检测波长：245 nm；进样体积：10 μL。

1.2.4 补骨脂素含量的测定

配制浓度为10～500 μg/mL的补骨脂素标准溶液，按照1.2.3的条件进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制作标准曲线。样品提取液按照1.2.3的条件进样后，根据标准曲线计算提取液中补骨脂素含量。最后根据称取样品的重量，换算成样品中补骨脂素的含量。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对五指毛桃补骨脂素提取效果

晏蕓等[10]的研究结果表明，一定浓度的乙醇溶液更有利于补骨脂素的提取。本实验选择常用的甲醇、乙醇、三氯甲烷以及50%甲醇、50%乙醇为提取溶剂。从图1中看出，在70℃水浴回流提取的条件下，补骨脂素的提取效果为50%乙醇、甲醇、50%甲醇优于乙醇和三氯甲烷。经统计学分析，乙醇、三氯甲烷与其他试剂的提取效果有显著性差异（p<0.05），甲醇、50%甲醇以及50%乙醇的提取效果没有显著性差异（p>0.05）。这说明，采用甲醇、50%乙醇和50%甲醇都能很好的将五指毛桃中的补骨脂素提取出来，但从安全和经济的角度考虑，选择50%乙醇为提取溶剂较好。

2.2 不同提取方式对五指毛桃补骨脂素提取效果

根据研究报道，五指毛桃中补骨脂素的提取方式有冷浸、加热回流、超声提取等方式。本文采用50%乙醇为提取溶剂，比较了冷浸3 h、冷浸1周、70℃水浴回流3 h、70℃超声提取30 min对五指毛桃中补骨脂素提取效果的影响。图2的结果表明，冷浸3 h与冷浸1周对补骨脂素的提取效果影响不显著（p>0.05），显著低于70℃水浴和超声方法的提取效果（p<0.05）。70℃水浴回流3 h与70℃超声提取30 min的提取效果相当（p>0.05），考虑到水浴回流提取所用的时间较长，效率低，不利于节约时间和能源。因此，选择超声提取方法较好。

2.3 超声条件对五指毛桃补骨脂素提取效果

2.3.1 乙醇浓度的影响

实验以浓度为40%～80%的乙醇为提取溶剂，比较在常温条件下超声提取，对补骨脂素的提取效果的影响。结果表明，浓度在40%～60%范围内，随着乙醇浓度的增加，补骨脂素能被更多的提取出来；而随着浓度继续增加，补骨脂素的提取效率却有所降低（图3）。实验结果与晏芸等[10]报道的随着乙醇浓度的增加，提取率先增加后降低是一致的。

2.3.2 料液比的影响

以60%乙醇为提取溶剂，考察料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25时对补骨脂素提取效果的影响。结果表明，不同料液比时提取效果略有差异，通过统计学分析发现，不同料液比处理间没有显著性差异。因此，为节约试剂考虑，选择料液比为1∶10（图4）。

2.3.3 超声起始温度的影响

实验选择的超声起始温度分别为30、40、60、80℃，研究了起始温度对五指毛桃补骨脂素提取效果的影响。结果表明，随着温度的升高，补骨脂素的提取效率先升高后降低，60℃时提取效率最高，如图5所示。这可能是因为温度升高，促进了传质和传热，从而提高了提取率，而温度过高，则会加速补骨脂素开环，使提取率降低[10]。

2.3.4 超声时间的影响

在以60%乙醇溶液为提取溶剂，料液比为1：10，超声起始温度为60℃的条件下，研究超声时间为10、20、30、40 min时补骨脂素的提取效果。实验结果表明，随着提取时间的延长，补骨脂素的提取率升高，30 min时提取效率最高，时间继续延长对提取率的影响不大（图6）。

2.3.5 颗粒度的影响

不同颗粒度样品均以60%乙醇为溶剂，料液比为1∶10，在60℃条件下超声提取30 min，得到的补骨脂素含量结果如图7所示。结果表明，随着颗粒减小，补骨脂素含量先增加后降低，颗粒度分别为70和100目时，补骨脂素含量最高，且没有显著性差异（p>0.05）。因此，认为70～100目时，提取效果较好。但颗粒度为200目时却不利于补骨脂素提取。可能的原因是颗粒越小，增加了物料与溶剂的接触面积，但过度粉碎，却易使物料黏在一起，从而影响有效成分的提取[11]。

2.4 五指毛桃中补骨脂素含量的测定

随机选取了10株五指毛桃，取其根，清洗、切片、干燥粉碎后过100目筛，采用60%乙醇为溶剂，料液比为1∶10，60℃超声提取30 min，过滤得滤液，定容至50 mL，按照1.2.4的方法测定提取液中补骨脂素，换算成样品中补骨脂素含量结果如表1所示。结果表明，相同样品间重复性较好，株间差异较大，单株补骨脂素含量最高达1.117 5 mg/g，最低仅0.155 0 mg/g，这可能与每株的生长状况不同有关。

3 结论与讨论

溶剂、温度、物料颗粒、提取时间均是影响样品中活性成分提取的主要因素。溶剂提取是根据“相似相溶”的原理，根据目标物质结构，选择适当的溶剂。根据补骨脂素的化学性质，乙醇和氯仿均是较好的提取溶剂，但是实验结果表明，乙醇和氯仿的提取效果不如甲醇以及50%乙醇，这可能是因为五指毛桃样品中其他化学物质的存在，影响了补骨脂素在溶剂中的溶出率。溶剂浓度实验说明，适量提高乙醇中水的比例有利于补骨脂素的溶出。温度是影响传热和传质效率的重要因素，60℃较适合补骨脂素的提取。超声时间越长越有利于补骨脂素的提取，但是30 min时补骨脂素几乎全部被提取出来，再延长提取时间，补骨脂素的含量也不会再增加。颗粒度实验说明样品颗粒为70～100目时更有利于补骨脂素的提取。

目前，对五指毛桃研究重点在测定方法的建立以及活性成分的分离与评价，而其中补骨脂素的提取方法各有不同。通过本实验，建立了五指毛桃中补骨脂素的提取方法：样品干燥后粉碎至颗粒70～100目，采用60%乙醇为溶剂，料液比为1∶10，60℃超声30 min。

实验最后随机选择了10株五指毛桃，采用本方法对不同单株样品中补骨脂素的含量进行检测，结果表明，相同样品的提取效果稳定，提取方法是可行的，但株间差异较大。是何原因造成补骨脂素在相同品种不同单株五指毛桃中含量差异较大，有待继续研究。

本方法与冷浸法和加热回流提取法相比，具有溶剂的危害性小、提取效率更高、重复性好等特点，是五指毛桃中补骨脂素提取的理想方法。

参考文献

[1] 澍宗万，范崔生，朱兆仪. 全国中草药汇编[M]. 上册. 北京：人民卫生出版社， 1975：155.

[2] 林 励，钟小清，魏 刚. 五指毛桃挥发性成分的GC-MS分析[J]. 中药材，2000（4）：206-207.

[3] 魏 刚，刘春玲，何建雄，等. 五指毛桃GC-MS特征指标成分群探讨[J]. 中医药学刊，2005（7）：1 249-1 251.

[4] 王 晓. 超临界CO2/超声波强化萃取-高速逆流色谱纯化技术的集成及其在生物活性成分研究中的应用[D]. 泰安：山东农业大学，2004.

[5] Wang X， Wang Y Q， Yuan J P， et al. An efficient new method for extraction， separation and purification of psoralen and isopsoralen from Fructus Psoraleae by supercritical fluid extraction and high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 2004， 1055 ： 135-140.

[6] 陈 勇，甄汉深，陈美燕. 五指毛桃中补骨脂素的含量测定[J]. 中药材，2002（4）：265-266.

[7] 钟镜金，刘占强，曾元儿，等. HPLC法测定五指毛桃药材中补骨脂素和佛手柑内酯的含量[J]. 中药新药与临床药理，2007（2）：126-128.

[8] 李 明，陈志维，黎玉翠，等. HPLC法测定五指毛桃中补骨脂素和芹菜素的含量[J]. 中药新药与临床药理，2009，20（1）：52-54.

[9] 王晓平，黄 翔，陆奇丰，等. HPLC测定不同叶型五指毛桃中补骨脂素的含量[J]. 中国实验方劑学杂志，2013，19（5）：93-95.

[10] 晏 芸，潘晓梅，肖国民. 补骨脂素超声提取工艺的优化[J]. 东南大学学报（自然科学版），2012，42（3）：516-520.

[11] 熊燕子. 八角茴香中莽草酸的提取工艺及其果渣中茴香油成分的分析研究[D]. 重庆：西南大学，2009.