产氨细菌design—expert软件优化浸铜实验

李广泽 雷丁丁 周生

摘 要：传统微生物浸出优化方法一般为单因素实验法和正交设计法，为了优化产氨浸铜细菌的浸出条件，基于一株高浸出率的产氨浸铜突变株，以浸出率为响应值，通过Plackett-Burman（PB）设计法筛选出影响浸出率的重要因素，通过最陡爬坡实验接近最大响应区域，使用响应曲面分析法建立连续变量曲面模型。分析浸出率预测模型，并结合初始浸出条件获得优化浸出条件：柠檬酸钠：15.5g/L，pH：9.25，温度：30.61℃，硫酸镁：0.2g/L，磷酸二氢钠2.1g/L，磷酸二氢钾：1.4g/L， 摇床转速：120r/min，接种量：20%。分别在优化浸出条件和原始浸出条件下进行浸出实验，二者浸出率分别为：53.26%和42.71%。

关键词：微生物浸出；design-expert；浸出优化

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.16.001

随着矿产资源的日益紧张，低品位矿石的开采和利用越来越受到人们的关注。微生物浸矿成本低、浸矿环境温和、绿色环保 [1]，适合处理低品位矿石，但传统微生物浸矿菌种较单一，主要聚焦在氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooxidans）的研究上[2]，其在处理硫化矿物上具有优势，但一般无法处理其他类型的矿物，同时在处理碱性脉石矿物时，会因为碱性脉石耗酸量大而导致pH波动大，微生物生长环境难以保证。碱性微生物浸出 [3-4]可以有效解决以上问题，其浸出环境为碱性，可以避免出现脉石矿物的高耗酸，防止pH大范围波动。高效碱性浸矿微生物的研究对于降低浸矿成本、实现绿色矿山、丰富微生物浸矿菌种具有重要意义。

浸出条件优化对提高微生物浸出率非常重要。巩冠群等人[5]优化了氧化亚铁硫杆菌的培养基及浸出条件，使菌株活性获得明显提高，最高脱硫效率达到76.2%。郭朝晖等人[6]通过正交设计和摇瓶实验，优化了Pb/Zn冶炼废渣中有价金属生物浸出条件，在优化条件下，金属Cu，Zn，In 和Ga 的浸出率分别达到95.5%，93.5%，85.0%和80.2%。通常浸出条件优化的方法为单次单因子法和正交实验设计法，单次单因子法无法考察各因素间的交互作用，因而无法总是获得最佳浸出条件[7]。正交实验注重如何合理科学的安排实验，可以找到最佳因素水平组合，但无法在整个区域上找到响应值与各因素的回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合[8]。响应曲面分析法实验次数少、周期短，并且可以获得各因素与响应值的回归方程，从而可以拟补以往实验方法存在的不足。本实验在前期工作中通过紫外诱变筛选出一株高浸出率的产氨浸铜突变株，为了进一步提高其浸铜潜力，本文以浸出率为响应值，通过Plackett-Burman（PB）设计法筛选出影响浸出率的重要因素，通过最陡爬坡实验接近最大相应区域，使用响应曲面分析法建立连续变量曲面模型，对影响浸出率的重要因素进行优化。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

菌种：碱性产氨细菌JAT-1，经16SRNA鉴定为Providencia sp. （普罗威登斯菌属）。

培养基成分：柠檬酸钠：10g/L、尿素：20g/L、K2HPO4：1.4g/L、Na2HPO4：2.1g/L、MgSO40.2g/L。

初始浸出条件：温度30℃，摇床转速120r/min，初始pH：7，接种量20%。

矿石：矿样为云南某矿氧化铜矿石，使用X射线衍射法对矿石进行铜物相分析，结果如表1，可以看出该矿石脉石矿物主要以硅酸盐为主，次有碳酸盐类及氧化物类，该铜矿石含泥量较高，为典型的难处理高碱性氧化铜矿石[9]。浸矿时采用加工至200目以下的矿样。

1.2 实验方法

本实验采用室内摇瓶，取对数期的细菌按一定的接种量接种至液体培养基中，按14%矿浆浓度加入200目矿样，于温度可调节的恒温气浴振荡器中振荡培养。不同时刻的浸出率通过取少量浸出液，检测铜离子浓度计算获得，取样后补充相同体积的新鲜培养基，以减少误差。

2 实验原理及方案

2.1 产氨细菌浸矿原理

Groudeva 等[10]曾使用尿素分解细菌进行过碳酸盐型铜矿浸出实验。研究显示，碱性产氨菌株通過分解尿素产氨，溶液中存在微生物对脉石的侵蚀作用、氨与铜的各类矿石的络合作用、碱性细菌的氧化还原作用、某些大分子蛋白质和胞外多聚物（EPS）的络合作用，矿浆中主要发生的反应有：

2.2 Plackett-Burman实验

根据前期单因素实验，得到了影响碱性产氨细菌的浸出率可能因素，对包括A-柠檬酸钠、B-Na2HPO4、C-KH2PO4、D-MgSO4、E-初始pH值、F-摇床转速、G-温度、H-接种量在内的9个因素进行考察，选用N=11的PB设计，为考虑误差，设置3个虚拟组，每个因素取高低两个水平，+1表示高水平、-1表示低水平。利用design-expert软件对实验结果进行各因素的显著性分析，选取P<0.05的因素为主要影响因素，得到对浸出率影响最大的几个因素。

2.3 最陡爬坡实验

响应曲面对方程的拟合只有在所考察区域相邻近的区域内才可以充分还原真实情况，而在其他区域内无法获得响应曲面和拟合方程。所以，应该在最大浸出率附近区域内建立有效的响应曲面方程。本实验根据PB实验结论确定爬坡方向，根据各因素响应值大小确定爬坡步长。

2.4 响应曲面实验设计

在PB实验得到影响浸出率最显著因素后，经过最陡爬坡实验确定响应曲面实验区域，以浸出率为响应指标设计实验，得到显著因素与响应值的等高线关系图与曲面响应图，并用多项式对实验数据进行拟合得到浸出率与显著因素的经验模型。3因素3水平Box-Behnken设计如表2所示：

2.5 优化验证实验

在最佳浸出条件和原始浸出条件下分别进行实验，验证预测模型的准确性与浸矿优化效果。

3 实验结果与分析

3.1 Plackett-Burman实验及结果分析

通过表4方差分析可以看出，8个因素中有3个为显著因素，其显著程度为：A-柠檬酸钠>E-pH值>G-温度。其中柠檬酸钠作为浸矿细菌的能源物质，起到至关重要的作用，pH值与温度则通过影响细菌的生长，从而影响浸出率。

3.2 最陡爬坡实验结果及分析

PB实验拟合出浸出率与8种成分的一阶方程为：

Y=-13.97292+2.39633A-0.18556B-0.31500C+0.65833D+1.94958E-0.039042F+0.59183G+0.042500H。一阶模型中A、E、G的系数均为正，可以确定柠檬酸钠、pH值和温度的最陡爬坡方向为正，爬坡步长的确定可参考相关资料[11]。此处确定A步长为2、E的步长为1、温度步长为5。爬坡实验结果表5显示，浸出率在X+3x到X+4x之间有最高点。因此，选取X+3x为之后中心组合实验中心点。

3.3 响应曲面实验结果及分析

图1显示柠檬酸钠量与pH交互影响的响应曲面及等高线图。由图可知，在本实验水平范围内，随着柠檬酸钠含量的增大，浸出率随之提高，最终达到最大值。这是因为柠檬酸钠为浸矿细菌的能源物质，在能源物质充足时，可以保证尿素完全水解产氨，并维持细菌活性。柠檬酸钠超量时，受细菌活性和产氨量的限制，浸出率不会再提升；当柠檬酸钠量小于14g/L时，无论pH如何变化浸出率都无法达到最高值，当柠檬酸钠量大于14g/L时，浸出率随pH增大呈先升高后降低的趋势，因此应该控制柠檬酸钠量在14g/L以上，浸出率可以达到本实验最高值。

图2显示柠檬酸钠与温度的交互影响及响应曲面图，与图1类似，柠檬酸钠量对浸出率有决定性影响，当柠檬酸钠量小于14g/L时无论温度如何变化都无法达到最高值，当柠檬酸钠量大于14g/L，温度在27℃和33℃之间时，浸出率有最高值。

图3显示pH与温度的交互影响及响应曲面图。由图可以看出，温度与pH的交互作用明显，二者存在协同作用。且在实验水平范围内，pH值在9～10、温度在29～33℃时浸出率有最大值。

利用Design Expert软件进行方差分析和二次多项回归拟合实验，以Y（浸出率）为响应值，以A（柠檬酸钠），B（pH），C（温度）为自变量，拟合得到多元二次回归方程：

Y=-260.83752+3.08888A+29.53865B+8.25494C-0.45938AB+0.010875AC+0.22450BC+0.12951A2-1.58292B2-0.17152C2

由表7得知，模型的Prob值<0.0001，失拟项（0.0973>0.05），说明该模型回归极显著，失拟不显著。模型的相关系数R2=99.47%，表明相关性很好，校正相关系数AdjR2=98.87%说明响应面98.87%的变化可以由此模型解释，总体来说，该模型能够较好的解释实验数据。

为了获得最高浸出率，对多元回归方程模型进行分析，存在稳定点：A=15.5，B=9.25，C=30.61，此时模型的预测值为50.8%。

3.4 回归方程的验证

为了检验模型的预测的准确性，在最佳浸出条件和原始浸出条件下分别进行实验，所得实际的浸出率分别为53.26%和42.71%。实际浸出率与模型的预测值较接近，说明模型较好的预测了浸出情况。

4 结论

（1）采用Plackett-Bruman实验，得到了对浸出率影响最显著的三个因素：柠檬酸钠，初始pH和温度，并通过最陡爬坡实验获得三因素曲面响应实验的中心点：柠檬酸钠=13.5g/L、pH=11、温度=35℃。

（2）采用3因素3水平曲面响应Box-Behnken设计，考察了柠檬酸钠量、初始pH和温度三个因素对浸出的影响，分析发现，当柠檬酸钠大于15g/L、pH在9～10、温度在29～33℃之间时浸出率有最大值，并获得了浸出率预测模型。

（3）对浸出模型进行分析，并结合初始浸出条件获得优化浸出条件：柠檬酸钠：15.5g/L，pH：9.25，温度：30.61℃，硫酸镁：0.2g/L，磷酸二氢钠2.1g/L，磷酸二氢钾：1.4g/L， 摇床转速：120r/min，接种量：20%。分别在优化浸出条件和原始浸出条件下进行浸出实验，浸出率分别为：53.26%和42.71%。

参考文献：

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[9]姚高辉，严佳龙，王洪江.高含泥氧化铜矿加温搅拌浸出试验研究[G].中国科技论文在线，2010，5（11）：855.

[10]Groudeva V I，Krumova K，Groudev S N.Bioleaching of a rich-in-carbonates copper ore at alkaline pH.J Advanced Materials Research，2007（20）：103.

[11]Montgomery D C.实验设计与分析[M].人民邮电出版社，2009.

作者简介：李广泽（1988-），男，硕士，助理采矿工程师，主要从事采矿工程、岩土力学方面的工作。