原发性乳腺弥漫大B细胞淋巴瘤临床和病理特征

汪园园 杨喆 邓元 常红云 李晓锋 张冠军 刘希

原发性乳腺弥漫大B细胞淋巴瘤（primary breast diffuse large B-cell lymphoma，PB-DLBCL）是恶性程度较高的淋巴瘤，约占原发性乳腺恶性肿瘤的0.5%，占非霍奇金淋巴瘤的1%，占结外淋巴瘤的3%［1］。由于PB-DLBCL进展较快，同时又较为少见，临床表现不典型，初诊时难以与乳腺癌或炎症等疾病区别，因此需重视对本病的诊治研究，避免误诊漏诊。尽管近年来证据表明，MYC基因重排已成为弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）预后判断的重要指标之一［2］，但在PB-DLBCL中MYC重排的情况仍少见报道。本研究分析西安交通大学第一附属医院8例PB-DLBCL的临床、病理组织学及免疫表型特点，采用原位杂交技术检测EB病毒编码的小RNA（epstein-Barr virus-encoded RNA，EBER）的表达，再使用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术检测MYC基因遗传学改变，探讨PB-DLBCL的临床病理及MYC基因遗传学特征，并进行文献复习，以加强对本病的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

收集西安交通大学第一附属医院2010年1月至2018年4月在病理科确诊的8例PB-DLBCL。参照2008年国际结外淋巴瘤研究小组［3］提出的原发性乳腺淋巴瘤诊断标准和2016年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）淋巴组织肿瘤分类修订版［2］，本研究PB-DLBCL的纳入标准为：①患者无乳腺外恶性淋巴瘤的既往史；②乳腺为病变首发部位，可伴有同时性或继发性的同侧腋窝淋巴结累及；③镜下可见乳腺组织与恶性淋巴组织共存，淋巴瘤细胞浸润乳腺小叶和导管，而乳腺上皮细胞无恶变；④高年资病理医师复阅病理切片，满足2016年WHO淋巴组织肿瘤分类修订版中弥漫大B细胞淋巴瘤的病理诊断标准。结合临床及影像学检查结果，按照Ann Arbor分期系统，对纳入的病例进行分期［4］。

8例PB-DLBCL均为女性患者，发病年龄34～68岁（平均为53.1岁）。均以发现乳腺肿物为主诉就诊，病程1周～30年。7例患者均无皮肤红肿、溃疡，无乳头糜烂及溢液；1例患者肿物进行性增大并伴皮肤红肿，局部疼痛。所有患者均无发热、盗汗和体重下降等淋巴瘤的全身表现即B症状。6例患者血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）正常，2例升高，分别为258.4 U/L和261.3 U/L。7例患者为单侧乳腺肿物，其中左侧5例，占62.5%，另1例患者为双侧乳腺肿物伴淋巴结累及。肿瘤最大直径1.8～7.4 cm，平均3.3 cm。行肿物穿刺活检术4例，占50%；行肿物局部切除活检术2例，占25%；行乳腺单纯切除术2例，占25%。根据Ann Arbor分期，ⅠEA期5例，ⅡEA期2例，ⅣE期1例（表1）。

表1 8例原发性乳腺弥漫大B细胞淋巴瘤的临床特征Table 1 Clinical features of the 8 cases of primary breast diffuse large B-cell lymphoma

1.2 方法

1.2.1 苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、免疫组织化学染色和判读

病变组织均由4%中性福尔马林液固定、石蜡包埋和HE染色。免疫组织化学染色方法为柠檬酸缓冲液微波修复抗原，使用BenchMark Ultra Ventana（Roche公司，瑞士）全自动免疫组织化学染色仪，按照说明书进行EnVision两步法行免疫组织化学染色。即用型一抗抗体如下：LCA、CD20、CD79α、CD3、CD10、BCL6、MUM1、BCL2、C-MYC、ALK、CD30、Ki-67、CK，抗体购自北京中杉和福州迈新生物技术开发有限公司。染色均设阳性对照及阴性对照。CD10、BCL6、MUM1、BCL2和C-MYC的免疫组织化学染色结果的判读标准采用半定量法，计算10个高倍视野下阳性细胞百分数的平均值。阳性细胞＞30%时为CD10、BCL6或MUM1（+），阳性细胞＞50%时为BCL2（+）［2，5］；阳性细胞≥40%为C-MYC（+）［6］。根据Hans分型法，将入组的PB-DLBCL分为生发中心B细胞型（germinal center B-cell，GCB）和非生发中心B细胞型（non-GCB）［5］。

1.2.2 EBER原位杂交

使用EBER原位杂交检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）检测肿瘤石蜡切片EBV的感染情况。主要步骤为切片脱蜡、水化后，室温下蛋白酶K消化切片5 min；蒸馏水洗涤后滴加杂交液，在ThermoBrite FISH杂交仪（Abbott Molecular公司，美国）中进行杂交，过夜。滴加一抗，37℃孵育30 min，PBS洗涤后加二抗，室温孵育20 min，PBS洗涤后加HRP，室温10 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，封片。EBER原位杂交阳性信号位于细胞核。

1.2.3 FISH检测及判读

使用MYC双色分离探针（CytoTest Inc公司，美国）对肿瘤组织的3 μm石蜡切片进行FISH染色，操作步骤按照试剂盒说明书进行。主要步骤为组织学切片脱蜡后，于95℃蒸馏水中煮片20 min；室温晾干，滴加胃蛋白酶消化液，37℃消化25 min；梯度乙醇（70%、90%和无水乙醇）脱水各3 min。室温晾干切片后，避光滴加MYC双色分离探针，盖好盖玻片并注意避免产生气泡，使杂交液分布均匀。橡胶水泥封片后于ThermoBrite FISH杂交仪内进行变性、杂交过夜。切片洗涤后，滴加DAPI复染剂到杂交区，盖上盖玻片，利用BX41荧光显微镜成像系统（Olympus公司，日本）和FISH图像分析软件进行荧光图像的观察、采集和分析。按试剂盒说明书判读标准，MYC正常信号为红色和绿色荧光融合的2个黄色信号，基因易位时为1黄1红1绿信号，基因扩增时为≥3个黄色信号。每个组织样本观察200个间期细胞核，计算异常信号细胞的百分比。以5例反应性增生淋巴结标本的MYCFISH结果按如下公式计算建立本实验室阈值，阳性阈值=假阳性信号频率的平均值+3倍标准差。按照试剂盒说明书及上述方法得到本实验室的MYC探针基因易位阳性阈值为4%，MYC基因扩增阳性阈值为8%。

2 结果

2.1 病理组织学形态结果

8例病例中，行肿物局部切除活检术及乳腺单纯切除术的4例肿物，病理大体检查显示，肿物切面灰白、灰黄及灰红色，实性，质地细腻或稍硬，肿物周界不清。

光镜下见肿瘤细胞弥漫或略呈结节状浸润乳腺组织，致乳腺正常结构消失，可见残存的乳腺小叶。2例病例可见松散的肿瘤细胞围绕残余乳腺导管略呈同心圆状排列（图1A）。肿瘤细胞呈中等-大的中心母或免疫母细胞样形态，其间可见散在的小淋巴细胞（图1B）。肿瘤细胞核呈圆形、卵圆形或空泡样，1例病例的肿瘤细胞核稍不规则。核膜增厚，中心母样肿瘤细胞核染色质较细，可见多个靠近核膜的小核仁；免疫母样肿瘤细胞核染色质较粗，可见位于中心的大核仁。肿瘤细胞胞浆较少至丰富，嗜碱性。核分裂象多见，并可见病理性核分裂象。8例病例均未见坏死，3例病例伴有间质轻度纤维化。

2.2 免疫表型结果

8例病例的肿瘤细胞均弥漫强阳性表达LCA、CD20（图1C）和CD79α。5例（62.5%）BCL6阳性、7例（87.5%）MUM1阳性、3例（37.5%）BCL2阳性（图1D）、3例（37.5%）C-MYC阳性（图1E）、Ki-67阳性率为65%～95%（图1F）。肿瘤细胞均呈CD10、CD3、ALK、CD30和CK阴性。残余的乳腺导管上皮可见CK阳性。根据Hans分型，本研究8例PB-DLBCL中，non-GCB型7例（87.5%），GCB型1例（12.5%）。根据C-MYC和BCL2蛋白表达结果，1例为C-MYC和BCL2双表达淋巴瘤，Hans分型为non-GCB（表2）。

2.3 EBER原位杂交和MYC FISH结果

8例病例EBER原位杂交均为阴性，无EBV感染（图1G）。MYC基因FISH染色结果显示，＞96%的细胞具有正常融合的2个黄色信号，8例病例基因易位和基因扩增均为阴性（图1H，表2）。

图1 原发性乳腺弥漫大B细胞淋巴瘤的病理学染色结果Figure 1 Pathological staining results of primary breast diffuse large B-cell lymphoma

表2 8例原发性乳腺弥漫大B细胞淋巴瘤的病理学特征Table 2 Pathological features of the 8 cases of primary breast diffuse large B-cell lymphoma

3 讨论

发生在乳腺的淋巴瘤分为原发性和继发性。1972年Wiseman等［7］提出原发性乳腺淋巴瘤诊断标准如下：①有足够的组织标本进行诊断，经病理确诊为淋巴瘤；②发病时无乳腺外淋巴瘤病史；③乳腺为首发部位，除区域淋巴结（同侧腋窝和锁骨上淋巴结）可受累外，无其他部位累及；④乳腺组织与淋巴瘤组织密切相连。2008年国际结外淋巴瘤研究小组对该诊断标准更新为，单侧或双侧乳腺病变为主要临床表现，伴/不伴区域淋巴结侵犯［2］。而继发性乳腺淋巴瘤是指全身性淋巴瘤继发累及乳腺。

原发性乳腺淋巴瘤少见，Taniguchi等［8］、Ryan等［3］和周智俊等［9］的报道显示，DLBCL是原发性乳腺淋巴瘤中的最常见的类型。由于DLBCL的优化管理有时与肿瘤原发部位相关，因此，研究起源于特定结外部位的DLBCL的独特的临床生物学行为是十分必要的。正如WHO将原发中枢神经系统的DLBCL列为一个独立亚型并进行特异性的评价和治疗［2］，由于PB-DLBCL原发部位的特殊性，Bierman等［10］和国际结外淋巴瘤研究小组的Ryan等［3］对PB-DLBCL是否可作为DLBCL的一个独立亚型进行了相关研究。通过该大宗病例分析，发现PB-DLBCL具有在对侧乳腺和其他结外部位复发等独特的临床病理特征［3］。因此，研究分析PB-DLBCL的临床病理特征，可促进临床病理诊治水平的进一步提高。

PB-DLBCL好发于中老年女性，大多数为单侧乳腺发病，Ryan等［3］的报道中，发病部位为右侧乳腺的占51%，左侧乳腺的占43%，双侧乳腺约占5%。本组研究中左侧的占62.5%，另有1例发病于双侧乳腺。需要注意的是，当双侧乳腺受累时，需仔细排除继发性乳腺淋巴瘤。PB-DLBCL一般表现为无痛性肿物，与皮肤无粘连，皮肤表面无橘皮样改变，乳头无凹陷和溢液，B症状少见［3，8-9］。部分病例可出现局部红肿、不适等，临床上难与乳腺炎症鉴别。既往报道和本组病例术前大多数诊断为乳腺癌或炎症［3，9，11］。Ryan等［3］的报道中约19%的患者LDH升高，本组有2例病例LDH升高，分别为258.4 U/L和261.3 U/L。根据1972年Wiseman等［7］提出的原发性乳腺淋巴瘤诊断标准，患者分期均为早期，即Ann ArborⅠE（仅表现为乳腺肿物）或ⅡE（乳腺肿物并累及区域淋巴结）。累及双侧乳腺的淋巴瘤分期仍有争议，研究发现该类病例侵袭性更强，预后更差，因此建议将其归为ⅣE期，约占5%［3］。

PB-DLBCL的确诊依靠肿物细针穿刺、肿物局部切除或乳腺切除术后的病理学检查。其组织学形态和免疫表型类似于淋巴结内原发的DLBCL。组织学形态上，乳腺原有结构被破坏，可见中-大的异型肿瘤细胞弥漫性或略呈结节状浸润，肿瘤细胞间可见残存的乳腺导管和散在的小淋巴细胞。部分病例肿瘤细胞粘附性差，呈单个散在的或单行条索状浸润于间质中或围绕乳腺导管，类似乳腺小叶癌的列兵样排列或靶环样结构。肿瘤细胞大多呈中心母或免疫母细胞样形态，核分裂象易见。肿瘤间质可有轻度的纤维化。免疫表型上，肿瘤细胞表达淋巴细胞标记物LCA和B细胞标记物（CD20和CD79α），而不表达上皮标记物CK［2，11］。本组的8例PB-DLBCL均符合上述病理诊断标准。

根据细胞起源，通过基因表达谱（gene expression profile，GEP）可以将弥漫大B细胞淋巴瘤分型为GCB和活化B细胞样（activated B-cell-like，ABC）［2］。这2种亚型在染色体突变、信号通路和临床预后等方面均存在差异，GCB亚型患者总体生存率好于ABC亚型［12］。但由于GEP尚未常规开展，因此2016年WHO淋巴组织肿瘤分类修订版推荐基于CD10、BCL6和MUM1的IHC染色的Hans分型法，作为GEP分型的有效替代［2］。既往研究报道PB-DLBCL中GCB和non-GCB的比例变化范围较大，GCB比例可从11.1%～39.3%［8-9，11，13-14］。本研究根据Hans分型［5］，7例（87.5%）为non-GCB，1例（12.5%）为GCB。2种亚型的预后意义有待积累更多病例进行随访和统计学分析。此外，具有生发中心B细胞免疫表型特征的DLBCL发生于结外比如乳腺等部位的病理机制仍不明确，有待进一步阐明［11］。

近来研究表明，C-MYC作为癌基因参与了DLBCL的发生发展过程，MYC的遗传学改变已成为DLBCL预后判断的重要指标之一［2］。MYC转录因子可起基因扩增和通过调节P53凋亡通路下调肿瘤细胞增殖能力的双重作用［15］。当用FISH检测确定淋巴瘤具有MYC重排伴BCL2重排和/或BCL6重排时，即为“双打击”或“三打击”淋巴瘤。2016年WHO分类已将其定义为“高级别B细胞淋巴瘤，伴MYC和BCL2和（或）BCL6重排”，预后较差［2］。如果淋巴瘤免疫表型呈C-MYC（＞40%）和BCL2（＞50%）阳性而基因重排阴性时，可归为“双表达”淋巴瘤，预后也不良，但稍好于“双打击”或“三打击”淋巴瘤［2，16-17］。因此在DLBCL中检测MYC的遗传学改变对指导临床治疗和预后评估具有重要意义。然而，我们注意到，尽管7%～21%的DLBCL可发生MYC基因重排［15］，在Taniguchi等［8］及本研究的报道中，PB-DLBCL均呈MYC基因重排FISH检测阴性，同时少数病例可呈C-MYC免疫表型阳性。目前，由于病例数有限，仍需累积病例进一步分析MYC基因在PB-DLBCL中的重排情况及与预后的关系。

综上，PB-DLBCL是原发于乳腺的少见的淋巴瘤，临床表现难与乳腺癌、乳腺炎症区别。其确诊需依赖病理组织学和免疫表型分析。组织学上，PB-DLBCL肿瘤细胞多表现为中等-大的中心母或免疫母细胞样形态，免疫表型分型大部分为non-GCB。目前研究尚未见PB-DLBCL中MYC基因重排阳性报道。PB-DLBCL的遗传性特征仍需积累病例进一步分析，特别是MYC基因重排在PB-DLBCL中的发生比例和意义。