输尿管不全梗阻大鼠输尿管平滑肌损伤及肌球蛋白表达变化的临床意义

安文亚，赵泽驹，罗逸航，辜浩，吴宇波

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563000)

输尿管不全梗阻临床较为多见，多与结石有关。研究发现，输尿管不全梗阻时间越长对机体的损害越重，且输尿管损害先于肾损害[1]。2016年11月～2017年9月,本研究观察了输尿管不全梗阻大鼠梗阻不同时间输尿管形态结构及平滑肌细胞肌球蛋白表达变化，旨在为临床判断输尿管不全梗阻患者的输尿管功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：健康10～12周龄SD大鼠120只，雌雄各半，体质量250～300 g，第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(渝)2012-0005。饲养于遵义医学院中心实验室，雌雄分开，普通标准饲料喂养，自由饮水，室温18～22 ℃，相对湿度45%～65%。试剂与仪器：肌球蛋白兔抗鼠一抗(SA1022)、抗体稀释液(AR10161)、即用型正常山羊血清(AR0009)，武汉博士德生物工程有限公司；肌球蛋白重链mRAN，南京金斯瑞生物科技有限公司。免疫组化检测试剂盒(GK500705)，上海基因科技股份有限公司；TransZol Up、逆转录与扩增试剂盒，北京全式金生物技术有限公司。CKX31普通光学倒置显微镜，日本Olympus公司；MyiQ2定量PCR仪，美国BIO-RAD公司。

1.2 输尿管不全梗阻模型制作 所有大鼠适应性饲养3周，随机分为对照组30只、假手术组45只和模型组45只。模型组参照腰大肌隧道包埋法[2,3]制作输尿管不全梗阻模型：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，下腹正中切口，腹腔探查，于膀胱附近分离、游离右侧输尿管下段约2.0 cm，于右侧输尿管后方腰大肌处钝性分离出一条长约2.0 cm、深约0.5 cm的裂隙，将游离的输尿管下段置于裂隙底部；腹腔放少量青霉素，1号丝线间断缝合2针关闭裂隙，缝合切口。假手术组分离裂隙后不放置游离的输尿管，其余操作同模型组。对照组不制作输尿管不全梗阻模型，正常饲养。

1.3 相关指标观察 造模1、2、3周随机选择对照组10只、假手术组及模型组各15只处死。对照组及假手术组探查腹腔，分离并切取右侧肾及输尿管；模型组找到右侧输尿管下段包埋处线结，分离显露输尿管、肾脏，贴膀胱壁剪断输尿管，挤压肾脏见尿液从近侧断端流出，切除右侧肾脏及输尿管。观察三组以下指标。①输尿管、肾脏形态及右侧输尿管直径：肉眼观察输尿管及肾脏形态，测量右侧输尿管三个横断面直径(游标卡尺0.05 mm)，结果取平均值。②输尿管平滑肌细胞形态：取输尿管用4%多聚甲醛固定、包埋、切片，采用HE染色观察不同时段输尿管平滑肌组织细胞结构变化。③输尿管平滑肌肌球蛋白表达：采用免疫组化SP法检测。取三组输尿管平滑肌组织切片，参照试剂盒说明书进行输尿管平滑肌肌球蛋白表达检测。以PBS代替一抗作为阴性对照。以平滑肌细胞胞质内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。采用Leica Qwin和Image-proplus6.0图像处理系统测量各组平均光密度(IOD)。④输尿管平滑肌肌球蛋白重链mRNA表达：采用qRT-PCR法检测。采用TRIzol法提取三组各时间点输尿管平滑肌肌球蛋白总RNA，以RNA为模板，按照EasyScript逆转录试剂盒说明合成cDNA，用TransStart试剂盒进行荧光定量PCR。基因扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。引物序列：肌球蛋白重链上游引物5′-GGCAAGAAGCAGATCCAGA-3′，下游引物5′-CTTCAACATTGCGCTTCTGT-3′；β-actin上游引物5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物5′-GGGGTGTTGAAGGTCTVAAA-3′。PCR反应体系：2×TransStart Tip Green qPCR Supermix 5.0 μL，10 mol/L上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O补足总体积至10 μL；每孔加入10 μL反应体系，每个样本设3个复孔。PCR反应条件：94.0 ℃变性30 s，94.0 ℃退火5 s，60.0 ℃延伸30 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 三组输尿管及肾脏形态比较 造模1、2、3周对照组与假手术组肾及输尿管形态比较无明显差异。与对照组与假手术组相比，模型组梗阻1周时近端输尿管稍增粗；肾脏体积略有增大、张力稍高；2周时输尿管增粗明显，壁厚；肾脏体积增大、包膜张力高、皮质变薄、肾盂扩张；3周时梗阻近端输尿管显著增粗，管壁明显变薄；肾脏体积增大、外形不规则，肾实质菲薄，肾盂、肾盏变形、扩大。模型组造模1、2、3周右侧输尿管直径逐渐增大，且均较对照组、假手术组增加(P均<0.01)；对照组与假手术组输尿管直径比较差异无统计学意义(P>均0.05)。见表1。

表1 三组右侧输尿管直径比较

注：与对照组及假手术组比较，△P<0.01。

2.2 三组输尿管平滑肌组织细胞形态比较 HE染色结果显示，对照组、假手术组输尿管平滑肌细胞各时段变化无明显差异，细胞层次清晰、排列整齐、胞质及胞核无明显异常。模型组1、2周梗阻近端输尿管平滑肌细胞出现代偿肥大增生，胞核增大，细胞排列部分紊乱，梗阻时间越长，上述表现越明显；但模型组3周时出现梗阻近端输尿管平滑肌细胞体积变小，细胞核萎缩，部分平滑肌细胞被增生的纤维结蹄组织替代，与模型组1、2周形成明显差别。

2.3 三组输尿管平滑肌肌球蛋白表达比较 造模1、2周，模型组输尿管平滑肌肌球蛋白表达量均高于对照组和假手术组，术后3周均低于对照组和假手术组，组间比较P均<0.01；造模1、2、3周,模型组肌球蛋白表达各时间点两两比较P均<0.01；对照组与假手术组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 三组输尿管平滑肌肌球蛋白表达比较

注：与对照组及假手术组比较，*P<0.01；与模型组造模1周比较，△P<0.01;与模型组造模2周比较，#P<0.01。

2.4 三组输尿管平滑肌肌球蛋白重链mRNA表达比较 造模1、2周,模型组输尿管平滑肌肌球蛋白重链mRNA相对表达量均高于对照组和假手术组，造模3周均低于对照组和假手术组，组间比较P均<0.01；造模1、2、3周，模型组肌球蛋白重链mRNA相对表达量各时间点两两比较P均<0.01；对照组与假手术组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 三组输尿管平滑肌肌球蛋白重链mRNA相对表达量比较

注：与对照组及假手术组比较，*P<0.01；与模型组造模1周比较，△P<0.01;与模型组造模2周比较，#P<0.01。

3 讨论

输尿管是肌性、管状、空腔器官，依赖平滑肌节律性收缩协助排尿。发生梗阻后尿液滞留，梗阻近端压力升高，输尿管、肾盂平滑肌收缩力反射性增加，以排出更多尿液缓解压力，保护肾脏泌尿功能[4]。输尿管完全梗阻时，随时间延长尿液潴留增加，近端积水及压力快速升高，肾盂压>10 mmHg时出现肾实质返流，肾血流分布改变，髓质流量增加，泌尿功能逐渐下降甚至停止，此时输尿管、肾盂维持高压，功能停止，不可逆性损害持续，出现萎缩性改变[5,6]。输尿管不全梗阻时，因始终有部分尿液排出，梗阻近端压力有一定程度缓解，输尿管、肾盂平滑肌收缩、扩张以期排出更多尿液，呈现由代偿到失代偿的转化过程。随梗阻时间延长，输尿管扩张、积水逐渐增加，波及肾脏，导致肾积水、体积增大、实质萎缩，最终使输尿管过度扩张增粗类似于“肠管”，巨大肾积水形成，输尿管管壁及肾实质均菲薄，肾单位耗竭。梗阻解除后输尿管及肾功能能否恢复与不全梗阻时间有关[7]。部分患者肾功能恢复，但近端输尿管过度扩张、积水，肾脏代偿性积水增大、实质萎缩，输尿管仍扩张、积水、收缩乏力，极易因再发小结石、尿盐结晶、脱落坏死组织或感染性脓苔等形成再梗阻，甚至诱发肾功能衰竭[8]。

在输尿管不全梗阻过程中，输尿管病理损害先于肾脏损害出现，且输尿管平滑肌最先受累[9]。梗阻早期输尿管即可出现肌细胞内离子稳态破坏、钙超载、线粒体和肌球蛋白等超微结构异常[10～12]；平滑肌细胞内钙离子平衡失调，导致钙离子分布紊乱，出现钙离子超载，通过影响线粒体膜通透性及钙调蛋白活性导致平滑肌细胞受损及凋亡[13]。平滑肌肌球蛋白由两条轻链和两条重链构成六聚体，两条重链通过C端的α-螺旋结构相互作用形成二聚体，构成肌球蛋白的主体[14]。肌球蛋白可分为头部、颈部和尾部三个部分。头部有与肌动蛋白结合部位及与ATP结合部位，与其长轴成角，因此也称为横桥；颈部是α-螺旋结构，可与两个轻链相结合，起着调整头部活动性的作用[15]；颈部之后是α-螺旋的尾部，末端是非螺旋化的较短的结构域。每个肌球蛋白分子含有两个完全相同的头部，都具有Ca2+-ATP酶活性，其活性直接影响肌纤维的收缩力量及速度。肌球蛋白的变化包括信使mRNA相对表达量、肌球蛋白表达量、肌球蛋白构象以及肌球蛋白活性改变等形式[16]。肌球蛋白对输尿管病理损害最为敏感，输尿管梗阻期间肌球蛋白的变化规律可反映不同时段输尿管平滑肌功能状态，对输尿管及肾脏损伤有预警作用。

本研究结果显示，模型组随梗阻时间延长，近端输尿管逐渐扩张，造模2、3周时肾盂扩张积水、肾脏体积增大，提示输尿管不全梗阻2、3周时已出现肾脏损害。形态学观察发现，梗阻2周时输尿管平滑肌肌层增厚，细胞代偿性增生肥大，细胞核变大，呈长梭型；但梗阻3周时管壁平滑肌纤维却明显减少，肌层变薄、细胞萎缩、核小而圆、细胞排列紊乱、纤维增生明显，与梗阻2周时比较差异显著。梗阻1、2周时肌球蛋白表达量逐渐增加，但3周时则显著降低，甚至低于对照组与假手术组；肌球蛋白重链mRNA相对表达量也呈类似变化。说明不全梗阻过程中，平滑肌细胞分子结构变化与形态结构改变相适应。上述变化提示梗阻3周时平滑肌细胞出现了不可逆性损伤[17]。输尿管梗阻后平滑肌细胞损害或凋亡增加使肌球蛋白重链mRNA表达量发生变化，进而影响肌球蛋白表达，最终导致其功能改变。白志明等[18]研究证实，肌球蛋白表达与其功能状态密切相关。本研究模型组梗阻2～3周期间肌球蛋白表达变化说明此段时间输尿管功能是代偿到失代偿的转化，梗阻2周内解除梗阻可阻止输尿管继续损害。

综上所述，输尿管不全梗阻时间越长、平滑肌损伤越重；梗阻超过2周将出现输尿管功能不可逆性损伤。