截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠血清和肝组织白细胞介素—6、肿瘤坏死因子—α及肝细胞超微结构的影响

侯伟欣 郝玉林 杨文龙 田甜 蒋天媛 张秋云 高连印 杜宇琼

摘要：目的 观察截断逆挽方对慢加急性肝衰竭（ACLF）大鼠血清和肝组织白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量及肝细胞超微结构的影响，探讨其部分作用机制。方法 采用人血清白蛋白免疫诱导肝纤维化联合D-氨基半乳糖/脂多糖急性攻击建立ACLF大鼠模型。将SPF级Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组和截断逆挽方组（中药组），中药组在急性攻击24 h后给予截断逆挽方连续灌胃，5、10、15 d后平行取材。透射电镜观察肝细胞超微结构变化，ELISA检测血清及肝组织IL-6、TNF-α含量。结果 与正常组比较，模型组各时间点大鼠血清及肝组织IL-6、TNF-α含量增加；与模型组比较，中药组血清及肝组织IL-6、TNF-α呈下降趋势，15 d改善最明显。透射电镜观察模型组大鼠肝细胞超微结构损伤程度随时间延长逐渐加重，各对应时间点中药组损伤程度明显减轻。结论 截断逆挽方能有效降低大鼠血清及肝组织IL-6、TNF-α水平，减轻肝细胞损伤，对肝细胞结构和功能有一定的保护作用。

关键词：截断逆挽方；慢加急性肝衰竭；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0049-04

Abstract： Objective To observe the effects of Jieduan Niwan Prescription on IL-6 and TNF-α in serum and hepatic tissue in acute-on-chronic liver failure rats （ACLF）； To study the partial mechanism of the treatment for ACLF. Methods The ACLF rat model was established by using human serum albumin immuno-induced hepatic fibrosis followed with D-galactosamine and lipopolysaccharide joint acute attack. The SPF Wistar male rats were randomly divided into normal group， model group and Jieduan Niwan Prescription group， respectively. The Jieduan Niwan Prescription group was treated by Jieduan Niwan Prescription after the acute attack for 24 h， and the rats were sacrificed respectively at 5， 10 and 15 days after gavage administration. Transmission electron microscope was employed to observe the ultrastructural changes in liver cells and ELISA was used to detect the contents of IL-6 and TNF-α in serum and liver tissue， respectively. Results Compared with the normal group， the contents of serum and liver tissue IL-6 and TNF-α in model group increased at each time point. Compared with the model group， the contents of serum and liver tissue IL-6 and TNF-α decreased in Jieduan Niwan Prescription group， especially in 15 days. Under the transmission electron microscope， the changes of ultrastructure of liver tissue were observed. With the passage of time， the degree of hepatocyte injury in model group gradually increased， but decreased significantly in Jieduan Niwan Prescription group at each time point. Conclusion Jieduan Niwan Prescription can effectively reduce the levels of IL-6 and TNF-α in serum and liver tissue， reduce the degree of liver damage， and has a certain protective

在我國，慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是威胁生命的重要杀手。目前仍缺乏有效治疗措施，该病西医多采用内科综合治疗、肝移植、人工肝支持治疗等，但效果欠佳。全国名中医钱英教授基于“毒损肝体”理论，结合自身临床经验，拟定截断逆挽方治疗ACLF，前期临床研究证实了该方的有效性[1]，前期实验表明该方可预防性降低ACLF大鼠血清及肝组织的部分炎症因子、减轻肝细胞过度凋亡、改善肝组织病理损伤[2-5]。本实验观察截断逆挽方给药5、10、15 d后大鼠血清及肝组织白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量及肝细胞超微结构变化，揭示其治疗ACLF大鼠的部分作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性Wistar大鼠105只，SPF级，体质量180～200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。饲养于首都医科大学SPF级实验动物房，室温（22.4±3.0）℃，相对湿度（51.3±2.2）%，光照明暗交替12 h/12 h，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备

截断逆挽方由苦味叶下珠30 g、瓜蒌30 g、金钱草30 g、黄芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、生地黄20 g、莪術6 g、丹参20 g、黑附片15 g组成，饮片购自北京同仁堂中医医院中药房。根据课题组前期实验得出有效剂量[3]，浓缩成含原药材4.34 g/mL。

1.3 主要试剂与仪器

人血清白蛋白（A9731-5G，Sigma公司），D-氨基半乳糖（G0500-25G，Sigma公司），脂多糖（109K4075，Sigma公司），Rat IL-6 ELISA（CRE005，北京四正柏生物科技有限公司），Rat TNF-α ELISA （CRE003，北京四正柏生物科技有限公司）。全自动多功能酶标仪（MULTISKAN MK3，美国Thermo），MINI shaker（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER），电热恒温培养箱（DH4000A，天津泰斯特），透射电子显微镜（HT7700，日立公司）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

参照文献[6]方法建立白蛋白免疫诱导型肝纤维化大鼠模型，5只Wistar雄性大鼠做正常对照，100只第6周行肝组织活检，肝纤维化Ⅲ级以上大鼠60只，继续攻击2周成肝硬化模型。随机分成模型组和截断逆挽方组（中药组），均采用文献[7]方法同时腹腔注射D-氨基半乳糖400 mg/kg及脂多糖100 μg/kg行急性攻击。存活并成模大鼠30只。中药组于急性攻击24 h后分别给予截断逆挽方药液连续灌胃5、10、15 d，正常组和模型组于相同时间点连续给予等体积生理盐水，给药体积为5 mL/kg，分别于给药5、10、15 d后平行取材。取材过程中，由于操作不当，致使中药5 d组1只大鼠取出很少量血且溶血，不足以进行相关血清检测，故该只大鼠未行血清检测。

2.2 血清白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α含量检测

腹腔注射10%水合氯醛大鼠麻醉，腹主动脉取血，4 ℃、3000 r/min离心15min，采集上层血清，ELISA检测血清IL-6、TNF-α含量，严格按试剂盒说明书操作。

2.3 肝组织白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α含量检测

将取下的肝左叶制成10%肝组织匀浆，4 ℃、4500 r/min离心5 min，收集上清液，ELISA检测肝组织IL-6、TNF-α含量，严格按试剂盒说明书操作。

2.4 透射电镜观察肝细胞超微结构

肝脏标本经2.5%戊二醛固定2 h，锇酸固定1 h，梯度乙醇脱水，环氧丙烷置换，环氧树脂包埋，切片（厚度70 nm），饱和醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察肝细胞及线粒体超微结构，并拍照。

3 统计学方法

采用SPSS23.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 截断逆挽方对模型大鼠血清和肝组织白细胞介素-6含量的影响

与正常组比较，模型组各时间点大鼠血清和肝组织IL-6含量增加，部分时点差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药组大鼠血清10、15 d和肝组织5、15 d IL-6含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1、表2。

4.2 截断逆挽方对模型大鼠血清和肝组织肿瘤坏死因子-α含量的影响

与正常组比较，模型组各时间点大鼠血清和肝组织TNF-α含量增加，且随时间推移逐渐上升，于15 d达高峰（P<0.01）；与模型组比较，中药组大鼠血清和肝组织15 d TNF-α含量明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表3、表4。

4.3 截断逆挽方对模型大鼠肝细胞及线粒体超微结构的影响

正常组大鼠肝细胞结构完整，细胞核大而圆且居中，异染色质少而分散，细胞膜完整，胞质均匀，发达并排列整齐的粗面内质网和丰富的线粒体广泛分布于胞质内，线粒体多呈球形或椭球形，嵴发达，双层膜结构完整。模型组5 d肝细胞肿胀，部分可见血窦受压，细胞核变形，核染色质凝集，内质网数量减少，其中粗面内质网脱颗粒且扩张明显，线粒体肿胀变形，基质中空，嵴断裂或消失，模糊不清。胞浆疏松，胞质内可见包涵体，且脂滴增多。模型组10 d肝细胞核呈现受损变形态势，核固缩，核染色质边集，内质网出现断裂，并片段化，线粒体膜破裂，嵴消失，空淡变形固缩，胞质内明显可见凋亡小体，肝血窦内充斥大量炎细胞。模型组15 d大量肝细胞核异形现象极为严重，核膜严重不规则皱缩，肝细胞结构严重破坏，残留少量细胞器且结构不清，内质网结构破坏严重，线粒体膜明显破裂且空泡化，不同阶段凋亡小体显著增多，可见Kupffer细胞吞噬凋亡小体及一些坏死物质。与同一时间点模型组比较，中药组大鼠肝细胞损伤程度明显减轻，细胞核稍有变形，给药15 d后，细胞核出现固缩现象，但核异形较为少见；内质网扩张断裂，但尚未消失；线粒体肿胀变形，但相比模型组较少出现膜破裂或固缩，炎性细胞浸润及凋亡小体较模型组显著减少。结果见图1、图2。

5 讨论

在我国，ACLF是一种较为常见的重症肝病，发病机制尚不完全明确。有学者提出“内毒素-巨噬细胞-细胞因子风暴”学说[8-11]。在内毒素的刺激下，诱导机体淋巴细胞、NK细胞和单核-巨噬细胞产生大量TNF-α、IL-6等炎症介质，引起肝细胞凋亡及坏死。同时，IL-6具有明显的中性粒细胞趋化及激活作用，能够损伤血管内皮细胞，从而加重肝脏炎症细胞浸润。并且IL-6可激活细胞毒性T细胞及NK细胞，溶解肝细胞，加重肝损伤。研究表明，血清IL-6、TNF-α水平可反映肝衰竭患者肝细胞损伤程度[12-13]。本实验采用D-氨基半乳糖/脂多糖联合急性攻击制备大鼠ACLF模型，其中D-氨基半乳糖干扰肝细胞磷酸尿嘧啶核苷代谢，诱导肝脏过氧化损伤，最终导致肝细胞坏死。脂多糖对肝细胞有直接损伤作用，同时还能下调单核巨噬细胞的吞噬功能并刺激其释放TNF-α、IL-6等炎性介质，参与肝衰竭的发展。

IL-6和TNF-α是细胞间传递信号的重要介质，在ACLF的发生发展过程中起重要作用，通过检测血清及肝组织IL-6和TNF-α水平可反映肝脏损伤程度。截断逆挽方预防性干预ACLF大鼠IL-6和TNF-α多有报道[2-5]，但基于二者含量探究截断逆挽方治疗ACLF大鼠疗效机制尚无相关报道。本研究通过对正常组、模型组和中药组各时间点间IL-6和TNF-α水平比较，结果发现，随时间推移，模型组血清及肝组织IL-6和TNF-α水平逐渐升高，呈递增趋势，且于15 d达高峰，这提示ACLF的发生发展与促炎因子TNF-α和IL-6水平升高有关，可能在肝脏损伤等病理过程中起重要作用。经截断逆挽方干预后，ACLF大鼠血清及肝组织IL-6和TNF-α水平呈降低趋势，且给药15 d差异最明显。表明中药组可有效降低炎症因子水平，并且给药时间越长，作用越显著。另外，前期预防实验研究表明，截断逆挽方可阻断线粒体凋亡途径[14]，对减轻肝细胞损伤有一定的预防作用。本实验通过观察肝细胞及线粒体超微结构直观发现：线粒体肿胀变形，随时间延长，损伤逐渐加重，至15 d破坏严重，线粒体空淡、变形、膜破裂显著增多，残留少量细胞器且结构不清，肝细胞大量凋亡且炎性浸润尤为明显。此时血清及肝组织TNF-α和IL-6水平也达高峰，由此推断，肝细胞及线粒体结构的破坏可能与炎症因子TNF-α和IL-6水平升高有关。而各时间点中药组损伤程度有所减轻，表明中药组可改善肝细胞超微结构破坏程度，保护肝细胞，延缓病情。

综上，截断逆挽方能降低ACLF大鼠血清和肝组织炎症因子IL-6、TNF-α水平，减轻肝细胞超微结构损伤程度，對肝细胞结构和功能有一定的保护作用。

参考文献：

[1] 胡建华，钱英，姚乃礼，等.“截断逆挽法”治疗慢性乙型重型肝炎临床疗效观察[J].中西医结合肝病杂志，2010，20（4）：200-203.

[2] 崔利娟，党泽方，张秋云，等.截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6的影响[J].中医药导报，2013，19（1）：8-11.

[3] 刘增利，吴文秀，张秋云.“截断逆挽方”对慢加急性肝衰竭大鼠ET、TNF-α含量的影响[J].中国医药导刊，2011，13（4）：650-652.

[4] 穆凌云，李金霞，张秋云，等.截断逆挽方对慢加急性肝衰竭模型大鼠血清TNF-α、肝组织p-JNK及c-Jun的影响[J].首都医科大学学报， 2017，38（2）：282-288.

[5] 崔利娟，吴文秀，邢金丽，等.截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠血清、肝组织TNF-α含量及肝组织TNFR1表达的影响[J].北京中医药，2013， 32（2）：134-138.

[6] 王宝恩，王志富，殷蔚荑，等.实验性免疫性肝纤维化模型的研究[J].中华医学杂志，1989，69（9）：503-505.

[7] 刘旭华，孟艳英，陈煜，等.采用免疫型肝硬化大鼠建立慢加急性肝衰竭模型方法的研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2008，17（10）：790-793.

[8] CHASTRE A， B?LANGER M， BEAUCHESNE E， et al. Inflammatory cascades driven by tumor necrosis factor-alpha play a major role in the progression of acute liver failure and its neurological complications[J]. PLoS One，2012，7（11）：e49670.

[9] 陈智.肝衰竭发生与发展过程中的免疫机制研究进展[J].中华肝脏病杂志，2012，20（10）：733-736.

[10] GORAL V， ATAYAN， KAPLAN A. The relation between pathogenesis of liver cirrhosis， hepatic encephalopathy and serum cytokine levels ： what is the role of tumor necrosis factor α[J]. Hepatogastroenterology，2011，58（107/108）：943.

[11] NOWAK M，GAINES G C，ROSNBERG J， et al. LPS-induced liver injury in d-galactosamine-sensitized mice requires secreted TNF-α and the TNF-p55 receptor[J]. American Journal of Physiology- Regulatory， Integrative and Comparative Physiology，2000，278（5）：R1202-R1209.

[12] LAI H S， LIN W H，LAI S L， et al. Interleukin-6 mediates angiotensinogen gene expression during Liver regeneration[J]. PLoS One，2013，8（7）：e67868.

[13] SEKIYAMA K D， YOSHIBA M， THOMSON A W， et al. Circulating proinflammatory cytokines （IL-1 beta， TNF-alpha， and IL-6） and IL-1 receptor antagonist （IL-1Ra） in fulminant hepatic failure and acute hepatitis[J]. Clin Exp Immunol，1994，98（1）：71-77.

[14] 李金霞，穆凌云，张秋云，等.截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠线粒体凋亡途径的影响[J].中国中医药信息杂志，2016，23（4）：45-48.

（收稿日期：2018-01-07）

（修回日期：2018-01-24；编辑：华强）