阿尼芬净中间体生物转化工艺研究

吴娟

摘 要：对放线菌来源的棘白霉素脱酰基酶产生菌ECBN的转化工艺进行研究，通过单菌筛选和转化时间两个方面的优化，确定最佳的转化条件，从而提高转化效率。

关键词：棘白霉素；阿尼芬净；转化效率；优化

棘白霉素类抗生素是21世纪初开发的新型药物，具有全新的作用机理，抗真菌谱较广，对念珠菌属以及曲霉菌属均有效，无交叉耐药性，无因其本身作用机制而引发的明显不良反应，是迄今为止安全性最高的一种抗真菌药物，也是目前用于治疗全身性真菌感染的新型药物。

近年来，棘白霉素类抗真菌药发展迅猛，已有卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净等多个广谱、低毒、高效的新化合物进入了临床研究 ，[1-3]作为棘白霉素类抗真菌药物阿尼芬净和米卡芬净，它们的合成过程是将其对应的棘白菌素类母核链接不同的侧链形成，其母核的形成是有对应的前体物质棘白霉素B和脱去侧链产生，因此脱酰基过程对于合成该类药物至关重要，化学方法反应条件剧烈，选择性又差，几乎没办法实现，文献报道可以通过微生物转化完成，所使用的转化菌株有游动放线菌属的菌株，尤其以犹他游动放线菌居多，和链霉菌属的菌株，包括环圈链霉菌与一些未确定种的链霉菌属菌株。

以阿尼芬净中间体ECB为底物，对筛选放线菌来源的棘白霉素脱酰基酶产生菌ECBN的转化工艺进行研究，通过单菌筛选和转化时间两个方面优化，确定最佳的转化条件，从而提高转化效率。

1 实验与方法

1.1 供试菌来源

供试菌来源于本实验室菌种库。

1.2 培养基

种子培养基：蔗糖2%，玉米淀粉2%（糊化），棉籽饼粉1%，酵母粉1%，碳酸钙0.2%，pH6.5。

发酵培养基：蔗糖3%，棉籽饼粉2%，酵母粉2%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钾0.1%，硫酸镁0.1%，碳酸钙0.2%，pH6.5。

1.3 方法

通过单菌分筛，转涂斜面，挑选优势单菌进行摇瓶试验。分别将单菌接种瓶，种瓶装量60mL/500mL瓶，30℃，250rpm摇床培养48h。按10%接种量接入发酵培养基，30℃，250 rpm，摇床培养4天。按2000u添加重含40.8%的ECB底物进行转化试验，定时取样，采用HPLC法测定发酵液效价来判断转化效率的高低。

1.4 HPLC檢测

高效色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity，色谱柱：xBridge Amide3.5um，流动相：乙腈-水（含7.8g L-1 NaH2PO4，pH3.0），波长：210 nm，进样量：10μL，流速：1mL min-1，柱温：40℃

2 结果与讨论

将保藏的棘白霉素脱酰基酶产生菌ECBN，涂平板，自然分筛，挑选出30株单菌进行斜面培养，再通过斜面外观，菌液，镜检，选出斜面外观比较饱满，菌液挂壁良好，镜检形态比较舒展的单菌共8株进行转化试验，结果可见表1。由表1可见通过菌种分筛试验，在转化时间相同的情况下，1号单菌与8号单菌转化效率较高。

选取1号单菌进行不同转化时间试验，控制转化18h、21h、24h检测效价，结果可见表2。由表2可见转化时间在21h时，转化效率最高。

通过单菌筛选获得优势单菌1号和8号，通过对1号单菌转化时间的考察，确定最佳转化时间为21小时，从而提高了转化效率。

参考文献：

[1]陈由页，曹国颖，傅得兴，等.棘白霉素类抗真菌药的研究进展[J].中国新药杂志，2007，16（14）：1082-1087.

[2]叶丽娟，朱辉，田敏.微生物来源的真菌细胞壁抑制剂的研究进展[J].国外医药抗生素分册，2005，26（1）：34-41.

[3]蒋正立，林建群，陈文红.棘白霉素类抗真菌药的研究新进展[J].天津药学，2005，17（5）：62-64.