乳酸菌和酵母菌发酵黄浆水制备有机酸工艺优化

乔明武，何人可，宋莲军，赵秋艳，庞晓晗

（河南农业大学食品科学技术学院，郑州市大豆深加工重点实验室，河南郑州 450002）

黄浆水作为传统豆制品生产排放的乳清废水，具有丰富的营养价值。黄浆水中富含蛋白质、大豆低聚糖、大豆异黄酮和大豆皂苷、一定量的B族维生素、有机酸、水溶性蛋白、氨基酸、脂类等营养成分，以及K，P，Ca，Fe等微量元素[1-6]。目前，大量的黄浆水主要作为工业废弃物被排放，所含丰富的营养素未被利用，其化学耗氧量（COD）、生物耗氧量（BOD） 值较高，总氮（TN） 和氨氮（NH3-N）也较高，属于高浓度废水，因此也极易腐败，严重污染环境。据报道，生产75 t豆制品所排放的废水，相当于2.5～3.0万人的城市一天的生活污水[2，5]。我国豆腐制品加工量较大，黄浆水的处理排放也给企业带来沉重的负担。因此，将黄浆水作为新的种质资源综合利用意义重大。

试验以黄浆水为主要培养基，以乳酸菌和酵母菌为发酵剂，通过对发酵产物的总酸度、pH值、氨基酸态氮和柠檬酸、醋酸、酒石酸、丁二酸、乳酸5种有机酸含量变化分析，确定最佳发酵工艺，以提高产酸量，为黄浆水富集产酸工业提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄豆，市售；内酯，由江西新黄海医药食品化工有限公司提供；消泡剂，由郑州市二七大河精细化工厂提供；乳酸菌、酵母菌，由微生物实验室保存。

1.2 仪器与设备

P680ALPG-4型高效液相色谱仪，戴安中国有限公司产品；TDL-5-A型台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品；SHZ-D型循环水式多用真空泵，河南智诚科技发展有限公司产品；BS-1EA型数显振荡培养箱、HY-5型回旋式振荡器，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；YXQG01型蒸汽消毒器，山东新华医疗器械厂产品；BCM-1000A型双人超净工作台，苏州安泰技术有限公司产品；FA2004A型电子天平，上海精天电子仪器有限公司产品；PHS-3CPH型测定仪，上海理达仪器厂产品；UV-2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 黄浆水的预处理

取一定量的黄浆水，以转速5000 r/min离心15min，取上清液。利用离子交换去除上清液黄浆水中的阳离子，每1 L黄浆水料液在3～4 min内匀速通过离子交换树脂，通过次数为10～15次。最后加入5%的活性炭，在120 W功率下超声50 min后，真空抽滤法去除活性炭，得黄浆水处理液备用。

1.3.2 发酵培养

取100 mL黄浆水处理液置于三角瓶中，添加2%葡萄糖，于121℃条件下灭菌15 min，冷却至室温后，从斜面接一环乳酸菌、酵母菌到100 mL黄浆水液体培养基中，于38℃条件下培养24 h，进行活化并扩大培养后备用。

取一定量添加2%葡萄糖的黄浆水培养基，按不同比例接种乳酸菌和酵母菌，在38℃条件下发酵72 h，分析发酵产物，确定最佳发酵工艺。

1.3.3 发酵产物含量测定

（1） 产酸总量的测定。采用GB 5009.239—2016食品安全国家标准食品酸度的测定的方法测定总酸。

（2） 氨基酸态氮测定。采用GB 5009.235—2016食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定的方法测定氨基酸态氮含量。

（3）黄浆水中有机酸含量测定。参考GB5009.157—2016食品安全国家标准食品有机酸的测定和李健等人[3]HPLC法进行有机酸的测定。色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18型色谱柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；检测器为紫外检测器，检测波长210 nm；流动相为甲醇、0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4缓冲溶液（3∶97，pH值2.85）；流速0.8 mL/min，柱温25℃，进样量20 μL。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌和酵母菌分别发酵产物含量对比结果

乳酸菌、酵母菌分别发酵黄浆水培养基时，对发酵产物总酸度、pH值、氨基态氮含量、有机酸含量进行对比。

乳酸菌和酵母菌发酵产物对比见表1。

表1 乳酸菌和酵母菌发酵产物对比

由表1可知，经乳酸菌、酵母菌发酵后的产物，有机酸含量均有显著性提高。乳酸菌发酵后产物与未发酵组相比，总酸度、氨基酸态氮、柠檬酸、醋酸、酒石酸、丁二酸和乳酸含量极显著性增加（p＜0.01），pH值显著性减小（p＜0.05）；酵母菌发酵后产物与未发酵组相比，氨基酸态氮、柠檬酸、醋酸、酒石酸和丁二酸含量极显著性增加（p＜0.01），总酸度和乳酸含量显著性增加（p＜0.05），pH值极显著性减小（p＜0.01）。乳酸发酵后，产物总酸度、氨基酸态氮、柠檬酸、酒石酸和乳酸含量大幅增加，且效果优于酵母菌发酵；酵母菌发酵后，产物醋酸含量大幅增加且效果优于乳酸发酵。

2.2 乳酸菌与酵母菌混合发酵产物含量结果2.2.1 总酸度和pH值变化结果

不同接种比例的乳酸菌和酵母菌混合发酵黄浆水培养基时，发酵产物总酸度和pH值的变化不同。

乳酸菌与酵母菌接种比对发酵产物总酸度的影响见图1，乳酸菌与酵母菌接种比对发酵产物pH值的影响见图2。

图1 乳酸菌与酵母菌接种比对发酵产物总酸度的影响

由图1可知，当乳酸菌与酵母菌接种比为1∶1时，酸度显著性最低（p＜0.05） 为5.5 g/L；当乳酸菌与酵母菌接种比为4∶1时，酸度显著性最高（p＜0.05） 为9.8 g/L，但低于单一乳酸菌发酵时的酸度11.0 g/L。

图2 乳酸菌与酵母菌接种比对发酵产物pH值的影响

由图2可知，当乳酸菌与酵母菌接种比为1∶1时，pH值最高为4.43；乳酸菌与酵母菌接种比为4∶1时，pH值最低为3.96，但大于乳酸菌发酵时的3.52，由此可知当乳酸菌发酵时pH值最高。

2.2.2 氨基态氮变化结果

不同接种比例的乳酸菌和酵母菌混合发酵黄浆水培养基时，对发酵物氨基态氮含量的变化情况进行研究。

乳酸菌与酵母菌接种比对发酵物氨基态氮含量的影响见图3。

图3 乳酸菌与酵母菌接种比对发酵物氨基态氮含量的影响

由图3可以看出，随着乳酸菌与酵母菌接种比的变化，乳酸菌接种量逐步增加，酵母菌接种量逐步减少，氨基态氮含量呈现基本递增的趋势，氨基态氮含量在乳酸菌与酵母菌接种比为4∶1时含量最高为0.39 g/L，但仍低于乳酸菌发酵时的氨基态氮含量0.41 g/L，说明氨基态氮最佳发酵方式为乳酸菌发酵，乳酸菌发酵可以有效增加蛋白质和氨基酸的含量，提高黄浆水的营养价值，尤其在生产γ-氨基丁酸方面前景广阔[5]。

2.2.3 有机酸变化结果

不同接种比例的乳酸菌和酵母菌混合发酵黄浆水培养基时，对发酵产物柠檬酸、醋酸、酒石酸、丁二酸、乳酸含量的情况进行研究。

乳酸菌与酵母菌接种比对有机酸含量的影响见图4。

由图4可以看出，发酵液中乳酸含量随着乳酸菌与酵母菌接种比的变化呈现递增趋势，在乳酸菌与酵母菌接种比为1∶1时，含量最低为0.991 5 g/L；乳酸菌与酵母菌接种比为4∶1时，含量为1.108 3 g/L，显著高于其他试验组（p＜0.05），但仍低于乳酸菌发酵时的柠檬酸含量1.207 2 g/L。

图4 乳酸菌与酵母菌接种比对有机酸含量的影响

醋酸含量随着乳酸菌与酵母菌接种比的变化呈递减趋势，在乳酸菌与酵母菌接种比为4∶1时，含量最低为0.685 7 g/L；乳酸菌与酵母菌接种比为1∶4时，含量最高为0.985 9 g/L，但仍低于酵母菌发酵时的柠檬酸含量1.074 6 g/L。

酒石酸含量随着乳酸菌与酵母菌接种比的变化含量呈递减趋势，在乳酸菌与酵母菌接种比为4∶1时，含量最低为2.170 1 g/L；乳酸菌与酵母菌接种比为1∶4时，含量最高为2.385 9 g/L。

丁二酸在发酵液中含量很低，且乳酸菌与酵母菌接种比对丁二酸含量的影响不大，在乳酸菌与酵母菌接种比为3∶2时，发酵液中丁二酸含量最高为0.074 0 g/L。

乳酸在发酵液中含量很低，但在乳酸菌、酵母菌接种比为2∶3和4∶1时，乳酸含量有明显提升；当乳酸菌与酵母菌接种比为4∶1时，含量最高为0.404 9 g/L，但仍低于乳酸菌发酵时的含量1.043 9 g/L，所以当乳酸菌发酵时乳酸含量最高为1.043 9 g/L，乳酸菌最佳发酵方式为乳酸菌发酵。采用联苯比色法对发酵液中乳酸含量进行单独测定，经过多次试验发现，发酵液中乳酸的含量为不可测出。说明乳酸在发酵液中的含量极低，可能是因为乳酸菌产生的乳酸迅速发生了转化，这与图4的液相结果相符合。

3 结论

黄浆水经乳酸菌、酵母菌发酵后的产物，有机酸含量均有显著性增加。乳酸菌发酵黄浆水时，产物中柠檬酸、酒石酸、乳酸含量大幅增加；酵母菌发酵黄浆水时，产物中醋酸含量大幅增加。乳酸菌和酵母菌联合发酵促进了产物有机酸含量的增加，为黄浆水工业化生产不同有机酸提供理论依据。因此，生产乳酸的最佳发酵方式为乳酸菌发酵，生产醋酸的最佳发酵方式为酵母菌发酵，生产酒石酸的最佳发酵方式为乳酸菌与酵母菌以接种比1∶4发酵，生产丁二酸最佳发酵方式为乳酸菌与酵母菌以接种比3∶2发酵。