马鞭草苷通过Wnt/β-catenin信号通路干预哮喘大鼠气道炎症及气道重塑的研究

朱颖涛 郭燕 乔岩岩 韩江伟

郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院1药学部，2住院管理处（郑州 450018）；河南医学高等专科学校药学系（郑州 451191）

哮喘是一种发病机制复杂的常见呼吸道疾病，尤其是儿童支气管哮喘，发病率逐年上升，已成为全球关注的公众健康问题。气道炎症、气道重塑是哮喘重要的病理特征［1]，也是导致中重度哮喘不可逆性和治疗困难的原因。β-肾上腺素受体激动剂及糖皮质激素可使气道炎症和急性气道高反应得到缓解，但患者仍经常发生气道重塑，肺功能下降，因此防治哮喘气道炎症及控制气道重塑具有重要意义。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路参与气道平滑肌细胞的增殖、迁移、分化［2]，而气道平滑肌细胞在气道炎症与气道重塑中扮演着重要角色。马鞭草苷是中药马鞭草的主要成分，具有抗炎、镇咳等生物活性［3]，但其对哮喘的作用及机制尚不明确。本研究通过哮喘大鼠模型，检测马鞭草苷对哮喘大鼠肺泡灌洗液中白细胞和炎症因子的影响，观察肺组织病理学和β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表达，评价马鞭草苷对哮喘大鼠气道炎症及气道重塑的作用，探讨马鞭草苷治疗哮喘的内在机制，为治疗相关疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料马鞭草苷（成都瑞芬思生物科技有限公司）；卵清白蛋白（OVA，美国Sigma公司）；白介素4（IL-4）、白介素5（IL-5）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；β-catenin、GSK-3β多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.2 动物模型建立与干预8周龄雄性SD大鼠，50只，购于河南省实验动物中心，随机分为正常（Con）组、模型（Mod）组、马鞭草苷低（VL，20 mg/kg）、中（VM，40 mg/kg）和高剂量（VH，80 mg/kg）组，每组10只。除正常组外，在第1天和第8天腹腔注射OVA（1 mg）与氢氧化铝凝胶（100 mg）混合液致敏［4]，第2天开始各组灌胃相应药物，正常组和模型组灌胃蒸馏水，从第15天开始灌胃后30 min以1%OVA雾化激发，每次30 min，隔天1次，连续4周。

1.3 肺泡灌洗液（BALF）中细胞因子和白细胞检测末次激发后2 h麻醉大鼠，打开胸腔暴露肺组织，气管插管，分离肺组织，结扎右主支气管，用5 mL生理盐水分2次于气管插管处注入，缓慢冲洗左肺，并按摩肺组织，约30 s后回收BALF，回收率在80%左右，将回收的BALF于4℃2 000 r/min离心10 min，ELISA法按试剂盒说明检测BALF中IL-4、IL-5、TNF-α的含量；沉渣用1 mL生理盐水悬浮，进行BALF细胞涂片，进行细胞计数及分类。

1.4 肺组织病理学观察取右肺近肺门组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行HE染色，每只大鼠随机选3张肺组织切片，每张切片以单盲法选取5支支气管显微镜下观察。应用Lecia Qwin V3图像分析软件测量肺组织支气管基底膜周径（Pbm），基底膜厚度和支气管平滑肌厚度。

1.5 Werstern blot检测取200 mg肺组织提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取适量蛋白煮沸变性，15%SDS-PAGE凝胶电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭，漂洗后加β-catenin或GSK-3β抗体4℃过夜，漂洗后以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，漂洗后ECL曝光成像，用Image-Pro Plus 6.0软件分析，以目的蛋白与内参β-actin的积分光密度的比值作为蛋白的表达。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间的比较采用单因素ANOVA检验和多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF中细胞计数及细胞分类与Con组比较，模型组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞增多，巨噬细胞减少（P＜0.05）。与Mod组比较，VM、VH组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞减少，巨噬细胞增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 BALF中细胞因子与Con组比较，模型组BALF中IL-4、IL-5和TNF-α显著升高（P＜ 0.05）。与Mod组比较，VM、VH组BALF中IL-4、IL-5和TNF-α水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 马鞭草苷对大鼠BALF中细胞总数及分类的影响Tab.1 Changes of total cellular score and cellular classification in BALFof rats（n=10） ± s

表1 马鞭草苷对大鼠BALF中细胞总数及分类的影响Tab.1 Changes of total cellular score and cellular classification in BALFof rats（n=10） ± s

注：与对照组比较，*P＜0.05；与Mod组比较，▲P＜0.05

组别Con组Mod组VL组VM组VH组细胞总数（108/L）2.68±0.81 7.43±1.56*6.02±1.35*4.96±1.14*▲3.89±1.06▲中性粒细胞（%）9.87±1.61 14.15±2.09*12.70±1.82*10.97±1.57▲10.36±1.60▲淋巴细胞（%）7.56±1.32 11.91±1.76*10.23±1.63*8.73±1.46 8.27±1.41▲巨噬细胞（%）81.38±3.76 66.71±3.21*71.17±3.09*76.45±3.28▲78.21±3.40▲嗜酸性粒细胞（%）1.18±0.53 7.22±1.26*5.89±1.03*▲3.84±0.80*▲3.15±0.71*▲

2.3 肺组织病理形态学HE染色显示，Con组肺组织未见异常，无气道重塑表现及炎性细胞浸润；Mon组支气管管腔狭窄，支气管壁厚度和平滑肌厚度明显增加，支气管、黏膜下及肺泡间质大量炎性细胞浸润；与Mon组比较，马鞭草苷各组炎性反应及气道重塑表现改善。见图1和表3。

2.4 肺组织β-catenin或GSK-3β表达Westernblot显示，与Con组比较，Mon组肺组织β-catenin蛋白表达增加，GSK-3β表达减少（P＜0.05）；与Mon组比较，VM、VH组大鼠肺组织中β-catenin表达减少，GSK-3β表达增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2和表4。

表2 马鞭草苷对大鼠BALF中细胞因子的影响Tab.2 Effect of verbenalin on the content of cytokine in BALFof rats（n=10）± s，ng/L

表2 马鞭草苷对大鼠BALF中细胞因子的影响Tab.2 Effect of verbenalin on the content of cytokine in BALFof rats（n=10）± s，ng/L

组别Con组Mod组VL组VM组VH组IL-4（ng/L）12.1±2.6 34.7±5.4*26.6±3.8*22.4±3.3*▲20.2±3.5*▲IL-5（ng/L）19.2±3.6 37.5±5.8*32.1±5.3*28.6±4.6*25.0±3.8▲TNF-α（ng/L）41.6±6.9 114.8±14.5*102.7±16.7*83.2±10.4*▲71.9±11.6*▲

3 讨论

图1 各组大鼠的肺组织病理（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of lung tissues in asthmatic rats（HEstaining，× 200）

表3 各组大鼠支气管基底膜周径、管壁厚度和平滑肌厚度Tab.3 Results of perimeter of basement membrane and thicknesses of bronchial wall and airwaysmooth muscle in different groups（n=10） ± s，μm

表3 各组大鼠支气管基底膜周径、管壁厚度和平滑肌厚度Tab.3 Results of perimeter of basement membrane and thicknesses of bronchial wall and airwaysmooth muscle in different groups（n=10） ± s，μm

注：与对照组比较，*P＜0.05；与Mod组比较，▲P＜0.05

组别Con组Mod组VL组VM组VH组基底膜周径2 159±171 2 282±219 2 128±188 2 263±227 2 193±206支气管壁厚度32.68±4.19 87.95±19.10*68.76±16.35*▲56.60±12.28*▲49.71±9.07*▲平滑肌厚度8.39±1.09 25.93±2.36*19.13 ± 2.20*▲16.59 ± 1.85*▲14.34 ± 1.51*▲

图2 大鼠肺组织中β-catenin和GSK-3β的蛋白表达Fig.2 The protein expression ofβ-catenin and GSK-3β in lung of rats

本实验使用OVA对大鼠进行致敏，再用OVA进行雾化攻击复制哮喘模型，从肺泡灌洗液中白细胞总数及分类、细胞因子、肺组织病理学考察模型的成功性。结果显示，模型大鼠支气管肺泡灌洗液中的白细胞总数明显增加，白细胞分类发现嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的比例提高。嗜酸性粒细胞和中性粒细胞是哮喘发病中的关键因素［5]，哮喘急性发作和慢性气道炎症均伴随着嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的大量浸润和聚集。哮喘的发展由炎症前细胞因子介导，主要包括Th2细胞分泌的IL-4、IL-5及Th1细胞分泌的TNF-α［6]。本研究显示检测模型大鼠的肺泡灌洗液中细胞因子IL-4、IL-5、TNF-α较正常大鼠明显升高，肺组织病理学发现大鼠支气管管腔狭窄，支气管壁厚度和平滑肌厚度明显增加，支气管、黏膜下及肺泡间质大量炎性细胞浸润。本实验所复制的大鼠模型表现出典型的气道炎症和气道重塑，而气道炎症、气道重塑是哮喘重要的病理特征。

表4 大鼠肺组织中β-catenin和GSK-3β的表达Tab.4 The protein expression ofβ-catenin and GSK-3β in lung of rats（n=10） x ± s

马鞭草苷为环烯醚萜苷类物质，是马鞭草中主要的极性成分，具有镇咳［7]、促进血管新生［8]、保护心脏［9]等生物活性。本研究发现马鞭草苷可降低哮喘大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞因子IL-4、IL-5、TNF-α的水平，减少白细胞总数，降低嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的比例。肺组织病理学显示马鞭草苷可改善哮喘大鼠支气管管腔狭窄、黏膜下及肺泡间质炎性细胞浸润、支气管壁厚度和平滑肌厚度增加的病理表现。有研究证实马鞭草苷的镇咳、抗炎活性，但马鞭草苷对哮喘引起的气道炎症和气道重塑的影响未见报道。本实验通过OVA致敏大鼠建立哮喘模型，发现马鞭草苷可抑制哮喘大鼠的气道炎症和气道重塑。

Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路与哮喘的关系十分密切，其可调控气道平滑肌细胞（ASMC）的增殖和分化功能。ASMC的增殖和迁移不仅是气道发生重塑的关键因素［11]，还是多种炎症介质释放的来源［12]。Wnt/β-catenin信号通路通过调节其下游核内原癌基因c-Myc及细胞周期蛋白D1调控ASMC的增殖、分化、迁移等，参与哮喘气道炎症和气道重塑的病理过程［13-14]。β-catenin是Wnt通路中的核心蛋白，而糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）调控β-catenin的降解，Wnt信号通路是否激活取决于GSK-3β水平［15]。本研究显示哮喘大鼠肺组织中β-catenin蛋白表达增加，GSK-3β表达减少，马鞭草苷可抑制哮喘大鼠肺中β-catenin表达，增加GSK-3β表达。马鞭草苷可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响ASMC，进而抑制炎症介质的释放和气道重塑的发展，发挥抗哮喘的作用。

本研究初步证实了马鞭草苷可能通过Wnt/βcatenin信号通路抑制哮喘大鼠的气道炎症和气道重塑，但马鞭草苷对下游信号分子的影响如何，其对ASMC增殖、迁移及分化的作用仍需深入探索。在下一步研究中，我们将结合体外细胞实验，分离哮喘大鼠ASMC，检测马鞭草苷对Wnt/β-catenin信号通路下游信号分子原癌基因c-Myc和细胞周期蛋白D1的影响，检测ASMC的增殖迁移，进一步阐明马鞭草苷抑制哮喘引起的气道炎症和气道重塑的作用及机制。