microRNA-21对急性心肌梗死早期诊断及短期预后判断的价值

郝谦 吴慧琴 杨捍卫

(中国人民解放军武汉总医院，湖北 武汉 430070)

急性心肌梗死(AMI)是冠心病中最常见且最致命的病症。在急诊科，对于AMI的早期诊断及恰当的救治方式是快速恢复心脏血流量以限制心肌坏死程度的重要因素，这在很大程度上影响患者的预后，降低患者并发症发生率[1]。微小RNA(microRNA，miR)是20～22个核苷酸组成的小的单链非编码RNA。能够通过抑制靶信使RNA的翻译或诱导其降解来下调蛋白质编码基因的表达[2]。一些miR可作为心脏功能衰老退化的标志基因，也可能是AMI的新型的生物标志物[3-4]。Zhang等[5]研究发现，AMI患者血浆miR-21水平显著升高，可能是AMI诊断的新型生物标志物。目前有关miR-21在AMI早期诊断及短期预后判断的价值尚不清楚。本研究比较了AMI患者常规用于临床诊断的cTnT与miR-21水平在AMI发病过程中的动态变化，并探讨miR-21对AMI早期诊断及预后判断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年4月～2016年6月因急性胸痛发作6h内急诊入院，且明确诊断为AMI的患者62例，其中急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)42例，急性非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)20例。纳入标准：①有胸痛症状，发病在6h内。②心电图、心肌标志物或心肌酶谱等指标符合2007年ACC/AHA制定的心肌梗死标准[6]。③冠脉造影检查显示有1支以上的冠脉血管狭窄超过50%。④经医院伦理委员会批准，患者自愿参加，签署知情同意书。排除标准：①因急性创伤引起的胸痛。②肺栓塞、主动脉夹层等引起的胸痛。③合并有肝肾功能不全、心脏瓣膜病、急性感染、血液系统疾病、恶性肿瘤等。另选取同期在本院体检中心体检健康者30例作为对照组。

1.2 方法 62例AMI患者分别于入院6h内、12h、24h、7d、14d采集静脉血；30例健康对照组在清晨空腹采集静脉血，3000r/min，离心10min，采集上清，置于无RNA酶的EP管中，-80℃冰箱保存。①cTnT检测：cTnT采用全自动电化学发光免疫分析仪(Elecsys 2010，Roche公司)进行测定。cTnT>0.1ng/mL为阳性，cTnT>0.5ng/mL为AMI诊断参考值。②miR-21检测：a.RNA抽提：按照mirVana PARIS试剂盒说明书(Ambion公司，美国)分离总RNA。使用NanoDrop ND-1000核酸定量检测仪检测RNA浓度和纯度(NanoDrop公司，美国)。b.qRT-PCR：按照TaqMan microRNA逆转录试剂盒说明书(Ambion公司，美国)进行逆转录，定量检测血浆样品中microRNA。qPCR在7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司)上进行。使用2-ΔΔCT方法计算相对表达水平，使用U6作为miR-21表达的内部对照。通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血浆miR-21相对表达水平。

1.3 临床随访 通过门诊复诊、电话进行定期随访，随访6个月，随访间隔1个月，观察患者随访期间主要心血管不良事件(MACE)包括心源性死亡和再发心肌梗死的发生情况。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，正态分布的计量资料以(x±s)表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；计数资料采用卡方检验，两指标之间的相关性采用Spearman相关分析；利用ROC曲线评价miR-21诊断AMI的能力。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料的比较 两组受试者在年龄、性别、血脂等基线特征比较，差异无统计学意义(P>0.05)。AMI组患者入院6h内cTnT水平明显高于对照组(P<0.01)，见表1。

2.2 两组血浆miR-21相对表达水平比较 与正常对照组比较，入院6h内血浆miR-21相对表达水平在AMI组患者中明显增高(t=10.096，P=0.000)，见图1。

2.3 血浆miR-21、cTnT在AMI发病过程中的变化 miR-21在入院6h内开始增高，12h达到高峰，24h、7d、14d逐渐下降至接近正常。cTnT在入院6h内开始增高，12h逐渐升高，24h达到高峰，7d、14d逐渐下降至接近正常，见图2、3。

2.4 相关性分析 经Spearman相关性分析结果显示，发病初血浆miR-21、cTnT水平呈正相关(r=0.667，P=0.000)，见图4。

2.5 血浆miR-21、cTnT对AMI的诊断价值 应用ROC曲线分析血浆miR-21、cTnT早期诊断AMI的价值，入院6h以内血浆miR-21的ROC曲线下面积(AUC)为0.939(95%CI：0.893～0.984，P=0.000)，当miR-21值>3.9时，敏感度为83.9%，特异度为86.7%，阳性预测值为92.9%，阴性预测值为72.2%；入院12h时miR-21的AUC为0.956(95%CI：0.918～0.994，P=0.000)，当miR-21值>4.8时，敏感度为83.9%，特异度为90.0%，阳性预测值为94.5%，阴性预测值为73.0%；入院6h以内cTnT的AUC为0.964(95%CI：0.932～0.996，P=0.000)，当cTnT值>0.18时，敏感度为90.3%，特异度为90.0%，阳性预测值为94.9%，阴性预测值为81.8%；入院12h时cTnT的AUC为0.979(95%CI：0.956～1.000，P=0.000)，当cTnT值>0.20时，敏感度为90.3%，特异度为93.3%，阳性预测值为96.6%，阴性预测值为82.4%，见图5。

表1 两组受试者临床资料的比较Table 1 Comparison of clinical data in each group

2.6 随访分析 62例AMI患者随访6个月，有9例患者发生MACE，其中心源性猝死2例，7例再次发生AMI；在入院6h内、12h、24h、7d、14d时间段，发生MACE的患者血浆miR-21相对表达水平与未发生MACE的患者比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)，见图6。

图1 入院6h以内两组miR-21相对表达水平的比较

Figure1ComparisonofrelativeexpressionlevelsofmiR-21betweenthetwogroupswithin6hadmission

3 讨论

研究表明，miR-21参与了心肌梗死的发病过程。管文娟等[7]研究发现，冠心病患者外周血miR-21高表达，AMI组血浆miR-21表达水平显著高于心绞痛组，且与冠脉病变的严重程度具有正相关性。Zhang等[8]研究发现，AMI患者血浆miR-21水平显着升高。

图2 血浆miR-21水平在AMI发病过程中的变化

Figure2ChangesofplasmamiR-21levelsduringthecourseofAMI

图3 cTnT水平在AMI发病过程中的变化Figure 3 cTnT levels in the pathogenesis of AMI

图4 血浆miR-21与cTnT水平的相关性分析

Figure4CorrelationAnalysisofPlasmamiR-21andcTnTLevels

图5 血浆miR-21和cTnT水平对AMI早期诊断的ROC曲线分析

Fig.5ROCcurveanalysisofplasmamiR-21andcTnTlevelsforearlydiagnosisofAMI

图6 miR-21在发生MACE和未发生MACE患者的波动图

Figure6FluctuationofmiR-21inpatientswithandwithoutMACE

与CK，CK-MB和cTnI相比，miR-21具有相似的诊断AMI能力，可能是AMI诊断的新型生物标志物。本研究旨在通过检测AMI患者血浆miR-21的相对表达水平，探讨其作为AMI早期诊断标志物的潜在价值。结果显示，AMI患者血浆miR-21水平较对照组明显增高，miR-21在入院6h内开始增高，12h达到高峰，24h、7d、14d逐渐下降至接近正常。cTnT在入院6h内开始增高，12h逐渐升高，24h达到高峰，7d、14d逐渐下降至接近正常。miR-21与经典AMI诊断指标cTnT相比，增高更早达到峰值。此外，miR-21与cTnT呈显著正相关。进一步采用ROC曲线分析对miR-21对AMI的早期诊断价值，结果显示，入院6h内、12h血浆miR-21的 AUC分别为0.939和0.956，入院6h内、12h血浆cTnT的AUC分别为0.964和0.979。根据Swets的诊断标准，当AUC在0.7～0.9之间时，ROC曲线更准确，AUC>0.9表示高准确率。miR-21与cTnT对AMI的诊断均有较高的敏感度和特异度，对于AMI具有可靠的诊断价值，但miR-21的诊断价值并不优于cTnT。

已有研究表明，miR-21在多种心血管疾病中起到重要的作用[9]。miR-21参与心房纤维化和心房颤动(AF)的发生，成纤维细胞富集miR-21，这有助于心血管系统的纤维化和心力衰竭的发展。其机制可能是miR-21通过上调WWP-1使TGF-β1/Smad2信号通路失活来抑制心脏成纤维细胞的增殖，是心房纤维性颤动中心房纤维化机制的新的见解[10-11]。研究证实，在梗死边缘和梗死区域的早期阶段(6h)中有多种miRNA异常表达[12]。Darabi等[13]研究发现，ACS患者血清miR-21水平显著高于稳定型冠状动脉疾病患者，miR-21增高可能通过促进炎症反应来参与ACS的发病机制。而抑制miR-21表达可通过M2巨噬细胞的抗炎作用来减少支架再狭窄[14]。miR-21参与了冠脉动脉粥样硬化过程，与调控炎性因子、促进炎症反应来影响斑块稳定性有关，miR-21增高导致冠心病患者心血管事件发生风险增高。本研究中62例AMI患者随访6个月，有9例发生MACE，在AMI发病过程中，不同时间点发生MACE的患者血浆miR-21相对表达水平均明显高于未发生MACE的患者，提示miR-21水平增高预示发生MACE的风险增高。miR-21对于AMI患者预后评估具有一定的参考价值。

血浆miR-21显示出一些诊断心血管疾病的潜力。然而，由于microRNA在生物系统中的复杂性，除了ACS患者具有不同遗传、社会和治疗特征之外，其他因素如纳入对象的选择，样本量大小也会对研究结果造成一定的影响[15]。本研究也存在一些不足之处：①患者样本量偏小且为单中心研究，以及未纳入心绞痛患者也都有可能影响研究结果；②研究发现，cTnT可以在1年内预测心肌梗死复发和死亡风险[16]。本研究随访时间较短，miR-21对发生MACE的近期和远期预后判断缺乏更有力的数据支持，这有待于后面的工作进一步随访观察分析。③虽然已有研究表明，miR-21在早期诊断AMI具有一定的临床价值，但相关的临床研究极少，miR-21检测和临床应用中的各种问题仍有待于进一步解决，包括如何快速检测出结果，缩短检测时间，临界诊断值的界定，以及miR-21水平在风险分层、与冠脉病变严重程度之间的关系、预后评估等问题需要进一步研究。

4 结论

本文资料显示，血浆miR-21相对表达水平在AMI患者中有明显增高，可能成为早期诊断AMI潜在的新型生物标志物。故miR-21水平对AMI的早期诊断和预后评估具有一定的临床参考价值，但并不优于cTnT检测价值。