HPLC法测定克班宁脂质体中克班宁的含量

刘娜 王琪蕾 陈凌云

【摘 要】 目的：用高效液相色谱测定脂质体中克班宁的含量。方法：色谱柱采用Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.008%三乙胺水=75∶25为流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。结果：克班宁在0.06～1.8mg/mL范围内有良好的线性关系，克班宁平均回收率为101.56%，RSD为6.77%。结论：本方法操作简便，結果准确，重现性好，适用于测定脂质体中克班宁的含量，便于质量控制。

【关键词】 高效液相色谱；脂质体；克班宁

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）14-0022-03

Abstract：Objective To study the determination method of Crebanine in liposome using HPLC. Methods The separation was performed on a Diamonsil C18 column（4.6mm×250mm， 5μm）， The mobile phase was composed of methanol-（0.008%）triethylamine solution （75∶25， V/V）， flow rate of 1.0mL/min， column temperature of 30℃， the detection wavelength of 280nm.Results Crebanine has a good linear relationship in 0.06～ 1.8mg/mL the linear range， the average recovery rate was 101.56%，RSD was 6.77%. Conclusion The method is simple， accurate， reproducible and suitable for the determination of the content of Crebanine in liposomes， easy quality control.

Keywords：HPLC； Liposome； Crebanine

克班宁（Crebanine，Cre）是由防己科千金藤属植物“山乌龟”中提取得到的异喹啉类阿朴菲型生物碱。前期研究发现[1-2]其具有较强的心血管药理活性，对多种实验性心律失常具有较强的对抗作用，且起效迅速，维持时间较短，是值得深入研究开发的生物活性物质。由于前期研究[3-5]已发现克班宁具显著活性的同时也有较明显的毒性，故研究将克班宁制成脂质体，使其毒性降低，安全有效地发挥其抗心律失常作用。本实验采用HPLC方法测定脂质体中克班宁的含量，操作简便，结果准确，重现性好，为克班宁脂质体的质量标准提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（自动进样器、二级管阵列检测器、恒温柱温箱）， C18色谱柱（Diamonsil C18， 4.6mm×250mm，5μm）； 电子天平（Sartorius BT 25s），SK 250 HP 超声清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 材料 克班宁对照品（自制[6]）；大豆磷脂（批号：20140202，上海太伟药业有限公司）；胆固醇（批号：20110708，中国新兴化工试剂研究所）；克班宁脂质体属于自制；甲醇、三乙胺等流动相所用试剂均为色谱纯，其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 克班宁脂质体的制备 采用逆向蒸发法制备空白脂质体，处方按照大豆卵磷脂、胆固醇质量比5∶1，并用适量氯仿溶解，加入量取一定量的pH为3的柠檬酸水溶液，超声混匀成W/O型乳剂，置旋转蒸发仪上30℃恒温水浴减压蒸发除去氯仿，得空白脂质体混悬液。以药值比1∶4取适量盐酸克班宁与空白脂质体混合均匀并用Na2HPO4调pH至5.8，50℃恒温水浴20min，即得克班宁脂质体。

2.2 样品溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取克班宁（含量94.1%）0.3g置100mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取“2.1”项下克班宁脂质体1mL置10mL容量瓶中，用甲醇超声溶解，并稀释至刻度，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，作为供试品。

2.2.3 阴性对照品溶液 精密称取卵磷脂3.3mg，胆固醇0.67mg置10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，即为阴性对照品。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18（ 4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-0.008%三乙胺水（75∶25）；流速为1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：280nm。

在上述色谱条件下，取克班宁标准品，克班宁脂质体供试品及阴性对照品，分别取10μL注入液相色谱仪进行测定。系统适应性测定结果（见表1）。克班宁的分离度大于9.10，理论塔板数按克班宁计算不少于5000，克班宁的拖尾因子为1.08。结果表明：样品中克班宁的色谱峰分离度、拖尾因子均能满足《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法项下规定，理论板数按克班宁计算均大于5000，因此该色谱条件适合于克班宁脂质体的分析，色谱图如图1所示。

2.4 线性关系考察 取“2.2”项下克班宁对照品，依次精密吸取0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、3mL的上述标准品溶液置于5mL的容量瓶中加甲醇定容，即得浓度为0.06、0.12、0.24、0.30、0.60、1.20、1.80mg/mL的克班宁系列标准品。分别精密吸取克班宁系列标准品溶液各10μL注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积（A）为纵坐标，进样量（C）为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果克班宁的回归方程为A= 1839.6C-604.65 （r=0.999），线性范围为0.06～1.8mg；表明克班宁在线性范围内峰面积与进样量有良好的线性关系。

2.5 精密度试验 分别精密吸取“2.2”项下供试品溶液各10μL，重复进样5次，测定峰面积，结果峰面积的RSD为0.007924%，小于3%，结果表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.2”项下供试品溶液，在0、2、4、6、8h分別进样10μL，测定峰面积，结果RSD值是0.024333%，小于3%，所以标准品溶液在8h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批次供试品6份，按照“2.2”项下方法，分别精密量取1mL，用甲醇定容于10mL容量瓶中，分别经微孔滤膜（0.45μm），过滤后再分别进样10μL，结果6份样品的平均RSD是0.303%小于5%，表明本法具有较好的重现性。

2.8 加样回收率试验 取“2.2”项下的标准品精取3mL分别用甲醇定容于10mL、50mL、100mL的容量瓶中，配得高（881.1μg/mL），中（440.55μg/mL），低（88.11μg/mL）克班宁对照溶液，分别取克班宁对照低、中浓度和高浓度各2mL置于10mL容量瓶中，再分别加入克班宁脂质体样品（2.81mg/mL）3mL于容量瓶，用甲醇定容，摇匀，经微孔滤膜（0.4μm）过滤后再分别取10μL注入液相色谱仪，照该品含量测定方法，测定含量，计算平均回收率为101.56%，RSD值为6.77%。表明本实验回收良好。见表2。

2.9 样品测定 取克班宁脂质体4批，依上述HPLC法测定克班宁脂质体中克班宁含量，每份样品测定两次，结果4批样品平均含量的53.95%，为后期研究工作提供研究方法。

3 讨论

脂质体作为新型药物输送系统，具有类细胞结构，能使药物延长药效、改变被包封药物的体内分布，提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低毒性。而克班宁毒性大、在动物体内为超速处置类（t1/2<1h）药物，利用脂质体作为输送介质，达到延长药效和降低毒性的目的。为后期克班宁在抗心律失常的应用提供基础研究。采用HPLC对克班宁脂质体进行含量测定，操作简便，结果准确，重现性好，可用于克班宁纳米脂质体的质量控制。在实验中，参照文献[7]流动相比例进行含量测定，而因脂质体膜材料即卵磷脂和胆固醇的影响，最终以甲醇-0.008%三乙胺水比例是75∶25能得到理想的分离效果。为克班宁脂质体的后续研究奠定基础。

参考文献

[1]李淑仪，杨秀英，王方材. 克班宁药理活性的初步研究[J]. 中药材， 1989， 20（9）：38-39.

[2] 淤泽溥，马云淑，赵子仙，等.克班宁的抗心律失常作用[J]. 中国中药杂志， 1992， 17（11）：587-685， 704.

[3] 马云淑，武鸿萍，张壮丽.克班宁急性毒性与抗心律失常活性的初步研究[J]. 中国现代应用药学， 2005（5）：18-19.

[4] 马云淑，商庆节，白一岑，等. 克班宁在大鼠体内的药动学[J]. 中国医院药学杂志， 2010， 30（10）：819-821.

[5] 马云淑，商庆节，白一岑，等. 克班宁注射剂在家兔体内的药动学研究[J]. 中国中药杂志， 2007， 32（7）：630-632.

[6] 马云淑，周发平，张状丽. 克班宁对照品的研究[J]. 中医药学刊， 2006， 24（6）：1038-1039.

[7] 张晓雷，马云淑，阎红，等. HPLC测定盐酸克班宁注射液中盐酸克班宁的含量[J]. 云南中医学院学报， 2006， 29（4）：3-5.

（收稿日期：2018-05-16 编辑：程鹏飞）