普洱熟茶茶多糖对ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化的作用研究

张晓明　王鹏　罗绍忠　杨继红 侯艳 邵宛芳 徐湘婷

【摘 要】 目的：探讨普洱熟茶提取物茶多糖对ApoE-/-小鼠高脂血症和动脉粥样硬化的作用。方法：24只ApoE-/-小鼠随机分为ApoE-/-对照组、茶多糖组、洛伐他汀组，另设8只相同遗传背景的C57BL/6J 小鼠为ApoE+/+对照组。4组分别给予蒸馏水、茶多糖、洛伐他汀、蒸馏水12周，实验结束后检测血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的含量；ELISA检测血清白介素-6（IL-6）及脂联素（APN）的含量；光镜观测主动脉病理形态学变化。结果：与ApoE-/-对照组相比，茶多糖组体重明显减轻（P<0.05）；TG、TC和LDL-C明显降低，HDL-C明显升高（P<0.05）；血清IL-6水平降低，APN水平升高（P<0.05）；光镜下主动脉损伤病变程度减轻。结论：普洱熟茶茶多糖有调节ApoE-/-小鼠血脂、保护血管内皮抗动脉粥样硬化的作用，作用机制可能与其抗炎作用有关。

【关键词】 ApoE-/-小鼠；动脉粥样硬化；茶多糖；白介素-6；脂联素

【中图分类号】R453 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）08-0027-04

Abstract：Objective To explore the effect of tea polysaccharides（TPS） from fermented Puer tea on atherosclerosis （AS） in ApoE-/- mice.Methods ApoE-/- mice were divided into 3 groups （n=8）： ApoE-/- control group， TPS group and lovastatin group. The mice of C57BL/ 6J were used as the ApoE+/+ control group（n=8）. The 4 groups of mice were administered with distilled water，TPS or lovastatin for 12 weeks. Triglyceride （TG）， total cholesterol（TC）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） levels were assayed. The concertrations of IL-6 and APN in serum were measured by ELISA. Pathomorphology changes of aortas were observated. Results The comparison between TPS group and ApoE-/- control group revealed that： Bodyweights were reduced obviously in TPS group（P<0.05）. Serum levels of TG，TC and LDL-C were decreased significantly in TPS group（P<0.05）.The contents of IL-6 were lowered markedly， and the level of APN increased obviously in TPS group（P<0.05）. The aortas pathological changes were relieved obviously in TPS group. Conclusions TPS from fermented Puer tea can regulate blood lipid levels and bodyweights of ApoE-/- mice.TPS can protect vascular endothelial cells to inhibit the development of atherosclerosis， and this mechanism may be related with anti-inflammation.

Keywords：ApoE-/- Mice； Atherosclerosis； Tea Polysaccharides； IL-6； APN

動脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病理基础，是与血脂代谢异常、内皮受损、平滑肌细胞增殖和血栓形成等有关的慢性炎症性疾病[1-2]。随着生活水平的提高和人口老龄化的日益严重，AS 的发病率越来越高，成为了世界范围内导致死亡的主要原因。研究显示，异常的脂质代谢和慢性炎症在AS 的发生发展中起着重要的作用。适当调整血脂水平能有效地降低动脉粥样硬化发病率[3-4]。临床上大多数降低血胆固醇水平的方法，需要严格控制饮食并依赖于药物，而降血脂药物的副作用使其应用受到了一定程度的限制。因此开发能够明显调节血脂的功能食品，对降低动脉粥样硬化的发病率具有重要的意义。普洱茶是云南特有的地理标志产品，是以符合普洱茶产地环境条件的云南大叶种晒青茶为原料，按特定的加工工艺生产的具有独特品质特征的茶叶。分为普洱生茶和普洱熟茶两大类型[5]。本次实验们使用载脂蛋白E基因敲除小鼠（Apolipoprotein E gene knockout mice， ApoE-/- mice）的动物模型，研究普洱熟茶中的茶多糖（Tea polysaccharides，TPS）抗ApoE-/-小鼠高脂血症和动脉粥样硬化的作用，为进一步有效地开发利用普洱茶，提供科学依据及理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57BL/6J 小鼠8只，雄性，（20±2）g，第三军医大学大坪医院，SCXK（渝）2007-0008；SPF级C57BL/6J ApoE敲除小鼠24只，雄性，（20±2）g，北京大学实验动物中心，SCXK（京）2006-0008。

1.2 受试物剂量设置及分组

1.2.1 受试物 普洱熟茶茶多糖由云南农业大学龙润普洱茶学院制备提供，4 ℃低温冷藏保存。所用茶叶样品由三个机构提供的不同来源的普洱茶熟饼1∶1∶1混合：①云南龙润茶业集团云南农大龙润普洱茶学院监制；②中国普洱茶研究院研制，云南省思茅茶树良种场生产；帕卡；③云南省农业科学院茶叶研究院西双版纳普洱茶研究院，勐海县云茶科技有限责任公司。

1.2.2 动物及分组 24只ApoE-/-小鼠随机分为3组：ApoE-/-对照组、茶多糖组、洛伐他汀组，每组8只动物；8只C57BL/6J 小鼠为ApoE+/+对照组。4组动物给予基础饲料，分别给予蒸馏水、茶多糖（500 mg/kg·bw）、洛伐他汀（10 mg/kg·bw）、蒸馏水。采用经口灌胃，给药容量均为0.2ml/10 g，每天早上9∶00～11∶00给药一次，连续给药12周[6-8]。

1.3 仪器 TMS-1024全自动生化分析仪（日本京都）；Diagnostics Ins.KDC-2046离心机（中国科技大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司）； BIO-RAD 550酶标仪（美国BIO-RAD公司）；Leica ASP200脱水机、Leica RM2145切片机、Leica EG1160包埋机均为德国莱卡公司；Nikon 50i显微镜及Mivnt图像分析系统（北京唯恩视信科技有限公司）。

1.4 观察指标

1.4.1 实验结束后，所有动物禁食不禁水12 h，摘眼球取血，4 ℃，3000 r/min离心10 min，取血清，放入-80 ℃ 冰箱冷冻待测。检测甘油三酯（Triglyceride， TG）、总胆固醇（Total Cholesterol， TC）、高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C）的含量；ELISA检测血清白介素-6（Interleukin-6， IL-6）及脂联素（Adiponectin， APN）。

1.4.2 从主动脉弓到髂总动脉分叉处摘取主动脉全段进行病理组织学检查。以“？”表示主动脉基本正常；“+”表示轻度病变，内膜完整性破坏，有泡沫细胞聚集，病变程度达到脂纹期甚至纤维斑块期；“++”表示中度病变，病变程度达到纤维斑块甚至是粥样斑块期；“+++”表示重度病变，出现斑块破裂、血栓、内出血、溃疡、动脉瘤等复合病变。

1.5 统计方法 应用SPSS 16.0统计软件包对试验数据进行统计学处理。计量资料以均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析（方差齐）或者秩和检验（方差不齐），等级资料采用秩和检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 普洱熟茶TPS对ApoE -/-小鼠体重的影响 普洱熟茶TPS连续给药8周、12周后体重均显著低于ApoE -/-对照组（P<0.05），提示普洱熟茶TPS有明显降低ApoE -/-小鼠体重的作用。见表1。

2.2 普洱熟茶TPS对ApoE-/-小鼠TG、 TC、LDL-C、HDL-C的影响 茶多糖组与ApoE-/-对照组相比，TC、TG、LDL-C含量降低，差异有统计学意义（P<0.05），提示普洱熟茶TPS能降低ApoE-/-小鼠血脂TC、TG、LDL-C水平。茶多糖组与ApoE-/-对照组相比，HDL-C含量增加，差异有统计学意义（P<0.05），提示普洱熟茶TPS能增加ApoE-/-小鼠血脂HDL-C水平。茶多糖组与洛伐他汀组相比，TG、TC、LDL-C及HDL-C水平差异均有统计学意义（P<0.05），提示普洱熟茶TPS调节血脂作用要弱于洛伐他汀组2。见表2。

2.3 主动脉病理学检查 由表3、图1可知，ApoE +/+对照组小鼠主动脉壁厚薄均匀，内膜、中膜和外膜未见异常。内膜完整，未见泡沫细胞聚集，无动脉粥样硬化病变形成。ApoE-/-对照组小鼠主动脉壁形成明显动脉粥样硬化斑块，提示AS造模成功。普洱熟茶茶多糖组动脉粥样硬化程度与ApoE-/-对照组相比明显减轻，多为早期粥样硬化。管壁可见轻度隆起和增厚、泡沫细胞聚集，病變程度较ApoE-/-对照组减轻，但无统计学意义（P>0.05）。

2.4 普洱熟茶TPS对ApoE-/-小鼠血清APN及IL-6的影响 由表4可知，与ApoE-/-对照组相比，普洱熟茶茶多糖组血清APN含量较高，差异有统计学意义（P<0.05），提示经普洱熟茶TPS干预后，ApoE-/-小鼠APN含量升高。与ApoE-/-对照组相比，普洱熟茶茶多糖组血清IL-6含量较低，差异有统计学意义（P<0.05），提示经普洱熟茶TPS干预后，ApoE-/-小鼠炎症因子IL-6水平降低。

3 讨论

TPS是从茶叶中提取的活性复合多糖的总称，包括酸性多糖、中性多糖、杂多糖和糖蛋白复合物等[9-11]。普洱熟茶属于后发酵茶，加工中的渥堆工序存在湿热作用和微生物酶解，许多化学成分大幅度下降，而水溶性茶多糖却大量增加了近5倍。研究显示，发酵茶类（乌龙茶、红茶、普洱熟茶等）茶多糖分子量低于未发酵茶类，提示发酵作用可改变茶多糖理化特性，提高茶多糖的含量和活性[12-14]。因而，普洱熟茶TPS的开发利用具有广阔的前景。

AS病理过程不仅与血脂代谢异常密切相关，还与炎症反应关系密切。高水平TC能致AS；而TG能加速AS和血栓形成的进程；LDL是血浆中主要带胆固醇的脂蛋白，可被丙二醛等脂质过氧化物氧化，被巨噬细胞上的消除受体摄取，并诱发泡沫细胞的形成，导致AS。实验结果显示，普洱熟茶TPS有调节ApoE-/-小鼠血脂的作用，血清TG、TC以及LDL-C降低，HDL-C升高，从而起到抗AS的作用。APN是由脂肪细胞分泌的细胞因子，通过与其受体结合，调节糖脂代谢、抗炎、保护血管和抗AS等。IL-6 是一种主要由活化的巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞等分泌的细胞因子，是介导机体炎症反应的重要细胞因子[15-16]。ApoE-/-小鼠可形成AS几乎所有阶段的病变，并与人类的病变非常相似，是研究AS发病机理和干预措施较理想的动物，故本实验采用 ApoE-/-小鼠作为实验组动物，同品系C57BL/6J小鼠（ApoE+/+）作为阴性对照组，考察普洱熟茶TPS对ApoE-/-小鼠AS的作用。实验结果显示，茶多糖组与ApoE-/-对照組相比，APN水平则显著升高、IL-6水平显著降低，从病理形态学上分析，茶多糖组主动脉粥样硬化损伤程度亦比ApoE-/-对照组减轻。提示给予普洱熟茶TPS 12周后，ApoE-/-小鼠炎症介质水平降低，炎症程度减轻，抗AS作用可能与其提高脂联素水平从而抑制炎症因子IL-6等生成有关。

综上所述，普洱熟茶TPS可能通过调节血脂紊乱，抑制炎症反应来减缓ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进程，我们的研究可为普洱熟茶TPS抗AS的开发利用提供新的思路。

参考文献

[1]张娜， 李林森. 炎症与动脉粥样硬化关系的新认识及有关中药的研究进展[J]. 药物评价研究， 2013， 36（4）： 302-306.

[2] Qin L， Zhu N， Ao BX， et al. Caveolae and caveolin-1 integrate reverse cholesterol transport and inflammation in atherosclerosis [J]. Int J Mol Sci， 2016， 17（3）： 429-435.

[3] Witztum J L， Lichtman A H. The influence of innate and adaptive immune responses on atherosclerosis [J]. Annu Rev Pathol Mech， 2014， 9（1）：73 -102.

[4] Libby P， Ridker PM， Hansson GK. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J]. Nature， 2011，473（ 7347） ： 317 -325.

[5] GB/T 22111-2008. 地理标志产品普洱茶[S]. 北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会， 2008.

[6] Nakashima Y， PlumbAS， ainesEW， et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb VascBiol，1994， 14（1） ：133-140.

[7] 程春华， 杨继红. 普洱茶对apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响[J]. 中国老年学杂志， 2012， 32（8）： 3241-3243.

[8] 郭杨志， 杨惠民， 程涓， 等. 调脂通脉颗粒对ApoE基因敲除小鼠主动脉弓NF-κB， ICAM-1及LFA-1的影响[J].北京中医药大学学报， 2014， 37（2）： 99-102.

[9] 张黎， 杨艳. 茶多糖药理活性研究进展[J]. 中国实用医药， 2013， 8（16）： 255-256.

[10] Nie S P， Xie M Y. A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities [J]. Food Hydrocolloids， 2011， 25（2）： 144-149.

[11] Cao H. Polysaccharides from Chinese tea：recent advance on bioactivity and function[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2013， 62： 76-79.

[12] 龚加顺， 胡小静， 彭春秀， 等. 普洱茶及其原料多糖分子组成及光谱学特性研究[J]. 光谱学与光谱分析， 2010， 30（7）： 1960-1964.

[13] 赵雪丰， 彭传赕， 谷勋刚，等. 普洱茶渥堆过程中茶多糖及果胶变化研究[J]. 安徽农业大学学报， 2012， 39（4）： 580-584.

[14] WANG Y F， SHAO S H， XU P， et al. Fermentation process enhanced production and bioactivities of oolong tea polysaccharides[J]. Food Research International， 2012， 46（1）：158-166.

[15] Gasbarrino K， Gorgui J， Nauche B， et al. Circulating adiponectin and carotid intimamedia thickness： A systematic review and meta-analysis[J]. Metabolism， 2016， 65（7）： 968-986.

[16] 李晶， 程文俊， 马宇虹.脂联素在心血管疾病中的研究进展[J]. 中国医药导报， 2016（9）： 76-79.

（收稿日期：2018-03-07 编辑：刘 斌）