基于DGT技术的土壤铅生物有效性评价研究

2018-09-17代允超张育林吕家珑

农业机械学报 2018年9期

代允超张育林吕家珑

(1.西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100； 2.农业部植物营养与农业环境重点实验室，陕西杨凌 712100)

0 引言

近年来，随着工业和经济的快速发展，带来了严重的环境污染问题，土壤重金属污染就是其中之一。土壤铅(Pb)污染因其长期持久性和对生物体的不可逆影响，一直是当前研究的热点之一[1]。研究表明，Pb单质虽不溶于水，但其化合物溶解性较强，会随着食物链被植物、动物和人体吸收，对生态环境、食品安全和人体健康造成威胁[2]。为了确保农产品生产的安全性，对土壤中Pb的生物有效性评估尤为重要。目前关于评价土壤中Pb生物有效性的方法有很多，但还没有一种方法被普遍接受和应用。

相关学者在评估土壤中重金属的生物有效性方面也做了很多相关研究，传统的评价重金属的生物有效性方法包括同位素稀释交换法、化学提取法和自由离子活度法等[3-5]。这些传统方法多是以平衡理论为依据，没能完全考虑重金属离子在植物根-土壤界面处的消耗以及消耗后所诱导的土壤液相-固相间的离子补充[6]，化学提取过程难以避免重金属离子的重新分配和再吸收，这可能导致结果误差[7]。另外，重金属在土壤中的生物有效性还与其在土壤中存在的形态、土壤性质及作物种类等有关。研究表明，土壤基本理化性质，如pH值、阳离子交换量(CEC)、粘粒含量和有机碳(OC)含量等都会影响植物的重金属吸收[8-9]，当研究重金属在土壤中的生物有效性时，要综合考虑土壤性质对重金属生物有效性的影响。

近年来，梯度薄膜扩散技术(DGT)被引入作为评估土壤中重金属生物有效性的新型技术[10]。DGT技术的原理是基于菲克第一扩散定律，即在单位时间内通过单位垂直截面积的扩散物质流量与该截面处的物质浓度成正相关关系。DGT技术是一项模拟植物从土壤吸收重金属的过程，并通过连续从土壤中吸收化学物质来评估生物有效性的技术。该技术不仅反映了土壤溶液中的重金属含量，还能反映重金属离子在从土壤固相向土壤液相间的动态供应，从而有效地测定土壤固相中重金属向液相的动态补给的化学过程[11-12]。DGT 技术已经用于评价土壤或沉积物中植物对多种重金属的生物有效性及吸收特性，如评价镉(Cd)、砷(As)在黑麦草、甘蔗中的生物有效性，并取得了不错的效果[11-16]。但也有学者研究发现，DGT在评价某些植物对某些重金属生物有效性时效果并不好[17]。小白菜作为我国大量消费的蔬菜，其根系发达且茎部较短，对重金属的吸收转运能力较强[18]，小白菜的安全生产关乎人类健康，但在用DGT技术对小白菜中Pb的生物有效性评价上还没有相关研究。

基于以上分析，本研究在我国15个省份采集不同理化性质的耕作土壤，外源添加重金属Pb模拟Pb污染土壤，以小白菜为研究对象，通过盆栽试验，比较DGT技术和传统化学方法评价土壤中Pb的生物有效性。首先使用简单回归分析，得出植物Pb含量和各种评价方法测定的土壤Pb含量之间的线性相关关系，但简单回归分析不能反映土壤性质对Pb生物有效性的影响，然后将土壤性质纳入回归分析，通过逐步多元线性回归来探讨，得出小白菜Pb含量与土壤Pb含量、土壤性质之间的相关关系，建立融合土壤基本理化性质的逐步多元回归模型方程，比较各方法评价土壤中Pb生物的有效性，为评价土壤Pb的生物有效性提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

采集我国15个省份理化性质差异较大的土壤，采样深度为0～20 cm，土壤样品风干后过20目尼龙筛，供土壤基本理化性质测定。分析方法参照《土壤农化分析》[19]。使用湿酸消解法(HNO3-HF-HClO4)对供试土壤样品进行消解处理，浸提液使用原子吸收分光光度计(Hitachiz-2000型，日本)测量其中的总Pb含量。供试土壤基本理化性质见表1。

1.2 试验布置和样品分析

通过盆栽试验，将外源Pb(硝酸铅PbNO3)加入到15个省份的土壤样品中(每盆装2 kg土壤)。根据GB 15618—1995《土壤环境质量标准》[20]二级土壤标准限定的Pb含量，设置3个Pb处理：CK、T1、T2，外源添加Pb的量分别为0、200、400 mg/kg，每个处理做3次重复，将所有盆栽进行随机排列，并置于自然条件下，老化3个月。在此期间，使用蒸馏水补水，使土壤含水率保持在田间最大持水量的80%。待土壤老化和均一化后，在每盆土壤中加入含有0.30 g N(尿素)、0.10 g P(Ca(H2PO4)2)和0.20 g K(K2SO4)的基肥。待种子萌发后，根据长势，每盆将幼苗定苗成2株。整个生长期间用去离子水保持土壤含水率在田间最大持水量的80%左右，以保障小白菜的正常生长。

生长60 d后收获小白菜，首先用自来水洗涤植物样品，然后用去离子水洗涤，擦干，称鲜质量。将洗净的植物样品90℃杀青后65℃干燥至恒质量，粉粹，在密封高压系统下用HNO3-H2O2对植物样品进行消化，然后用原子吸收分光光度计测量植物样品中的总Pb含量。并将收获小白菜后的土壤进行收集、风干，过2 mm尼龙筛，用于测定土壤各形态的Pb含量。

表1 供试土壤基本理化性质Tab.1 Basic properties of selected soil

注：土壤编号以pH值为序。

1.3 土壤中有效态Pb的测定方法

1.3.1DGT提取法

DGT装置购自维申有限责任公司(中国南京)，并按照标准程序操作[21]。先将50 g过2 mm筛的风干土壤放入塑料盒中，加水使其保持最大持水量(MWHC)的60%条件下48 h，然后在保持80%MWHC的条件下保持24 h，使土壤呈黏糊状且表面光滑。然后，将DGT装置轻缓地压入土壤表面，确保DGT滤膜与土壤充分接触。在DGT浸提期间使温度保持在(20±1)℃。放置24 h后，从土壤样品中回收所有DGT装置，用蒸馏水洗涤以除去粘附在装置上的土壤颗粒，并将装置拆分。将吸附胶用1 mL 1 mol/L硝酸洗脱24 h，稀释待测。使用原子吸收分光光度计测量洗脱液中的Pb含量。

1.3.2土壤溶液法和一步提取法

土壤溶液Pb浓度根据传统的离心法测定，在回收DGT装置后，将土壤转移到50 mL聚乙烯试管中并离心(5 000 r/min，15 min)以提取土壤溶液[22]，供测试使用。

3种传统的一步提取法使用的浸提剂分别为提取物包括0.05 mol/L的EDTA、0.01 mol/L的CaCl2和0.11 mol/L的HAc，操作步骤：①EDTA，称取土壤2.0 g于50 mL离心管中，加入20 mL 0.05 mol/L的EDTA浸提剂，振荡2 h，过滤[22]。②HAc，称取土壤0.5 g于50 mL离心管中，加入20 mL 0.11 mol/L的HAc，振荡16 h，过滤[23]。③CaCl2，称取土壤2.0 g于50 mL离心管中，加入20 mL 0.01 mol/L的CaCl2，振荡3 h，过滤[24]。所有浸提液中Pb含量通过原子吸收分光光度计测定。

1.4 统计分析

DGT测量的Pb质量比为[12]

CDGT=MΔg/(DAt)

(1)

式中CDGT——DGT法测定的Pb质量比，mg/kg

M——浸提时间内Pb的累积质量，μg

Δg——扩散层的厚度，cm

D——扩散层中Pb的扩散系数，cm2/s

A——DGT吸附窗口的面积，cm2

t——DGT浸提时间，s

运用Excel 2003进行数据分析和图表绘制，采用SPSS 23.0软件进行差异显著性分析和Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 外源Pb对小白菜生物量的影响

供试土壤性质变化差异很大，其中pH值范围为4.90～8.80，阳离子交换量质量摩尔浓度范围为8.70～31.11 cmol/kg，OC质量比范围为6.78～20.70 g/kg，碳酸钙质量比范围为0～53.57 g/kg，粘粒质量分数范围为6.66%～42.91%。由图1(图中不同土壤各处理间的相同小写字母表示在0.05水平下差异不显著，不同小写字母表示在0.05水平下差异显著)可以看出，15种土壤上3个处理的小白菜生物量的平均值为35.66 g，其中CK、T1和T2处理的平均生物量分别为36.37、36.28、34.33 g。与CK相比，添加Pb的处理T1和T2之间的生物量在p<0.05水平下没有显著差异，说明在这两种Pb处理水平下未对小白菜的生长造成显著的促进或抑制作用。

图1 15种不同土壤中小白菜生物量的比较Fig.1 Comparison of plant biomass in 15 different soils

2.2 小白菜对Pb的富集量

由图2可以看出，在所有15种土壤中，小白菜中的平均Pb质量比为0.291 mg/kg，CK、T1、T2处理的小白菜中的总Pb质量比范围分别为0.025～0.181 mg/kg(平均值0.103 mg/kg)，0.208～0.416 mg/kg(平均值0.304 mg/kg)和0.404～0.571 mg/kg(平均值0.466 mg/kg)，3个处理间比较，T2处理小白菜Pb质量比在p<0.05水平下显著高于T1，T1处理小白菜Pb质量比在p<0.05水平下又显著高于CK。酸性土壤(A～G)和碱性土壤(H～O)土壤的平均小白菜Pb质量比分别为0.326、0.260 mg/kg，这可能是由于碱性土壤中Pb的生物有效性较酸性土壤低。土壤C、F、G的平均小白菜Pb质量比分别为0.297、0.265、0.267 mg/kg，显著低于酸性土壤(A～G)小白菜Pb质量比的平均值(0.326 mg/kg)，这可能是由于这3种酸性土壤中的OC质量比较高(分别为19.87、20.70、19.05 mg/kg)，增加了土壤对重金属的吸收，从而降低了Pb在土壤中的生物有效性。

图2 15种不同土壤中小白菜对Pb的吸收量Fig.2 Pb uptake by plants grown in 15 different soil

2.3 小白菜中Pb含量与土壤中Pb含量的相关性

用DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法分别测量的小白菜中Pb质量比和土壤Pb质量比之间的关系如图3所示。EDTA、HAc、CaCl2方法测定土壤Pb质量比范围分别为：8.7～87.94 mg/kg (平均值44.61 mg/kg)、0.47～27.05 mg/kg (平均值10.06 mg/kg)、0.50～8.78 mg/kg (平均值4.06 mg/kg)，说明EDTA对土壤Pb具有最强的浸提能力，其次是HAc，最后是CaCl2。

DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法在评价小白菜中Pb生物有效性的能力各不相同，线性回归分析的决定系数R2分别为：0.97、0.92、0.88、0.80、0.78、0.72，由此可知，各方法评价小白菜对Pb的生物有效性顺序由大到小为：DGT法、土壤溶液法、EDTA法、 HAc法、CaCl2法、全量法。

2.4 小白菜富集Pb的预测模型

通过逐步多元线性回归，土壤性质(pH值，OC含量、CEC含量、CaCO3含量、粘土含量、氧化铁含量和氧化铝含量)和土壤Pb含量作自变量，小白菜中的Pb含量为因变量，对不同土壤测定方法(DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法)测量的土壤Pb含量进行逐步多元线性回归，得到的预测模型见表2(Cplant为小白菜Pb质量比，CDGT、CSol、CEDTA、CHAc、CCaCl2、CTotal分别表示DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法测定的土壤Pb质量比，CH+为土壤pH值，COC为土壤有机碳质量比)，可以看出，综合考虑土壤理化性质的影响后，基于6种分析方法提取的土壤有效态Pb所构建的多元回归模型均呈显著或极显著回归关系，且Pb在土壤中的生物有效性与土壤中的Pb含量呈正相关，而与土壤pH值和OC含量呈负相关。通过逐步多元线性回归，将土壤理化性质归入预测方程，提高了各方法小白菜Pb含量与土壤Pb含量之间的相关关系，通过比较图3和表2可以看出，除DGT方法的R2与简单线性回归相比保持相同外，土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和总量法在将土壤pH值和OC含量加入后，较简单回归分析的R2分别从0.92、0.88、0.80、0.78、0.72提高到0.94、0.90、0.85、0.83、0.78。

图3 小白菜Pb质量比和不同方法测得土壤Pb质量比之间的关系Fig.3 Relationships between plant and soil Pb concentrations

预测方程R2pCplant=0.156CDGT-0.0660.97<0.01Cplant=0.1617CSol-0.013CH+-0.005COC+0.1140.94<0.01Cplant=0.0865CEDTA-0.013CH+-0.003COC+0.0720.90<0.01Cplant=0.1134CHAc-0.014CH+-0.004COC+0.1360.85<0.01Cplant=0.1361CCaCl2-0.017CH+-0.006COC+0.1490.83<0.01Cplant=0.0026CTotal-0.034CH+-0.005COC+0.3500.78<0.05

注：p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著，下同。

表3为不同分析方法提取的土壤有效态Pb含量、pH值和OC含量在回归方程中与小白菜Pb含量相关关系的显著性差异分析结果。可以看出，土壤pH值和OC含量显著影响土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法，但是对DGT法没有显著影响。综合来看，与简单线性回归结果类似，逐步多元线性回归的决定系数R2由大到小依次为：DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法、全量法。DGT法所构建的预测模型决定系数较其他5种传统分析方法更高，且不受土壤理化性质的影响，是一种预测小白菜Pb生物有效性的较优方法。

表3 回归方程中各系数的显著性检验(p)Tab.3 Significant difference tests between factors in linear regression models (p)

3 讨论

几种单一浸提剂中，EDTA的浸出能力最强，其次是HAc，CaCl2浸提能力最弱，其原因可能是EDTA是一种较强的非专性螯合剂，能够提取的重金属形态包括水溶态、可交换态、矿物态和有机结合态；HAc是一种酸性提取剂，主要提取的重金属形态包括水溶态、可交换态和碳酸盐结合态；而CaCl2是中性盐提取剂，只能提取可交换态金属[25-26]。简单线性回归和逐步多元线性回归都表明，与传统的提取方法相比，DGT技术提供了一种能更好评估Pb生物有效性的方法。虽然单一的化学提取法作为利用率较高的评价方法相对比较成熟，但其存在一定的不科学性，如EDTA因其强螯能力较强，可将有机或残渣态等对生物有效性无贡献的形态提取出而导致所测结果偏大；HAc自身属弱酸性，可能对土壤结构产生破坏而使提取值与真实值存在差异；中性盐CaCl2利用静态离子交换原理，测定的可交换态金属易于被植物吸收利用，但土壤中有部分生物可利用的重金属(如土壤溶液或颗粒中不稳定的矿物态) 可能未被交换提取出来，导致不能正确评估土壤中重金属的生物有效性[21]。

土壤理化性质会影响重金属在土壤中的生物有效性，研究表明，土壤pH值和OC含量会影响重金属在土壤溶液中的生物有效性以及其在液相和固相之间的分布[27-29]。降低土壤pH值通常会使土壤中Pb的移动变强。因此，与酸性土壤相比，碱性土壤对Pb具有更强的缓冲能力，有研究表明，茶叶、冬小麦Pb含量与土壤pH值呈负相关[30-31]。土壤OC含量也会影响植物对Pb的吸收，因为OC可以将土壤中的重金属吸附在土壤胶体中，降低被植物吸收的量[8]。因此，Pb在pH值和OC含量较高的土壤中生物有效性较低。土壤性质参数，如pH值、OC含量、CEC含量和粘土含量可能影响Pb在土壤中的生物有效性[31]。传统的提取方法没有完全考虑土壤特性对重金属生物有效性的影响，因为它们不包括植物吸收重金属的动力学过程，因此只反映土壤金属的平衡状态[13]。本研究表明，传统的提取方法评价Pb的生物有效性时受土壤pH值和OC含量的影响最大，在将土壤性质纳入回归方程后，植物中重金属含量和土壤重金属含量的决定系数显著增大，且模型回归关系极显著。因此，当这些传统的测定技术用于评价重金属的生物有效性时，应当把土壤性质的影响考虑进来，以前的研究也有类似的结果[32-33]。多元回归分析表明，在预测Pb生物有效性时，DGT技术优于传统的提取方法，且不受土壤理化性质影响。TIAN等[13]通过多元回归分析，得出DGT技术包含了一些公认的影响重金属在土壤中生物有效性的因素，如pH值、CEC含量、OC含量等，且DGT技术几乎不受土壤基本性质的影响。宋宁宁等[14]在研究黑麦草镉(Cd)生物有效性时发现，DGT技术综合了土壤性质对土壤有效态Cd含量的影响，其所构建的方程也几乎不受土壤性质的影响。DGT装置由滤膜、扩散膜和吸附膜组成，由DGT的测定过程和原理可以知道，它先将土壤溶液中的重金属吸附到扩散膜上，然后扩散膜上的重金属再被吸附膜吸附测定，所以通过吸附膜测定的重金属含量是从扩散膜上扩散得到的，故其不受土壤性质的影响。

本研究表明，与传统评价方法相比，DGT在评价土壤重金属上效果较优。SONG等[34]采用硝酸铵提取、EDTA提取等多种传统的形态分析方法和DGT技术研究Elsholtziasplendens和Silenevulgaris在30种不同类型土壤中生长对铜吸收的有效性，研究表明，DGT提取的有效态铜含量与植物体内的铜含量的相关性明显优于全量法、EDTA法、土壤溶液法等传统方法。TIAN等[13]研究水稻及其根际土壤，利用土壤溶液法、HAc提取、CaCl2提取和DGT技术分析水稻根际中镉、铜、铅和锌的生物有效态含量，结果表明，DGT测定的根际土壤重金属含量与水稻中重金属含量的相关性比其他方法都好。王芳丽等[35]利用DGT方法和传统的化学方法对广西环江流域甘蔗根际土中Cd的生物有效性进行研究时发现，DGT法较传统化学方法能更好地预测甘蔗对Cd的生物有效性。ZHAO等[36]在欧洲18种性质不同的土壤上研究重金属铜对大麦根长度和西红柿生长的影响，发现在评价铜生物有效性上，DGT方法效果较土壤溶液法和自由离子活度法更优。NOLAN等[12]利用DGT法对小麦中的 Zn、Cd和Pb的生物可利用性进行了评价，结果表明DGT法可以很好地预测Zn、Cd 和Pb在植物中的累积。前面的研究虽然对Pb的生物有效性有所关注，但是土壤重金属生物有效性受土壤性质和作物种类的影响，小白菜作为我国大量消费的蔬菜之一，与其他植物对Pb的吸收转化特征有所差异，小白菜对重金属的富集能力较强[18]，而前面的研究较少关注，因此本研究选择小白菜为研究对象，研究结果具有较强的实用价值。

DGT之所以表现出较好的效果，与DGT的测定原理分不开，DGT技术基于动力学原理，考虑了元素在环境中的强度、容量及扩散速率，DGT技术测定的有效态浓度不仅包括土壤溶液中的重金属，还包括测量期间从土壤固相动态释放的重金属含量[11]。植物对重金属的吸收导致根部附近土壤溶液中的重金属浓度下降，并促使土壤颗粒态重金属补充给土壤溶液，这个动态反应过程对于重金属的生物有效性评价是不可忽略的，DGT可很好地模拟植物根系对重金属的吸收过程。Pb从固相到液相的动态交换过程也是影响小白菜Pb吸收的重要因素，随着浸提时间的进行，DGT装置表面附近的土壤溶液中的Pb浓度也随之降低，并在土壤液体和DGT扩散凝胶中产生扩散梯度，进而产生从土壤固相到土壤液相的离子通量，这个过程与植物根在土壤中吸收重金属时发生的过程相同。