不同培养条件对翠云草颜色的影响

金卓　丁滨　王照磊　倪鑫涛　王超

摘 要：本研究通过拍照、利用CAD软件计算对比明确了0.2mg/L 2，4-D（2，4- 二氯苯酚代乙酚）能显著促进翠云草生长；激素和土壤对翠云草叶色变化影响不明显；翠云草叶片中叶绿素a/b比值为2.26±0.04；在蓝色光照射下叶片中两种叶绿素含量显著增加，单克叶片中PAL的活性和翠雀素-3-O-葡萄糖的浓度显著增加，肉眼观察翠云草叶片呈蓝色。

关键词：翠云草；培养条件；叶绿素；翠雀素；苯丙氨酸解氨酶（PAL）

中图分类号：S682.35 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）21-0046-03

Abstract： In this study， it was found that 0.2 mg/L 2o-D（2， 4-dichlorophenol） could significantly promote the growth of Turquoise grass by taking photos and calculating and contrasting with CAD software， but the effects of hormones and soil on the leaf color of Turquoise grass were not obvious. The ratio of chlorophyll a/b was 2.26±0.04. Under blue light irradiation， the contents of chlorophyll in leaves increased significantly， the activity of PAL and the concentration of aliphin-3-O-glucose in single gram leaves increased significantly. The leaves of Turquoise grass showed blue color by naked eye observation.

Keywords： Turquoise grass； culture condition； chlorophyll； lark； phenylalanine ammonia-lyase （PAL）

翠云草（Selaginella uncinnata）屬蕨类石松亚门卷柏属多年生草本植物，别称蓝地柏、绿绒草、蓝草等，是一种在我国南部山区较为常见的蕨类。翠云草，因其特有性质和娇俏外形而具有“动静”两方面的应用价值：“动”可药用[1]，已有研究发现翠云草中富含黄酮、酚类、甾体皂苷类等化学成分[2-3]，具有一定的抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、平喘、祛痰止咳、抗菌等活性[4-5]，现己建立起合理可行的质量控制方法，具有较好的开发前景；“静”可观赏，翠云草布叶匀称，蔓生抬头， 为小型观叶植物。翠云草株态灵奇，全年翠绿光润偶带蓝色荧光，在花卉市场上是十分畅销的观叶盆栽[6]。室内做盆栽装点，室外还可做植被点缀，且水培、土培和沙培皆宜，效果别具一格。

在实际培育翠云草的过程中，由于其有生长速度慢，受环境影响大，蓝叶色不易显现等现象，很难以观赏植物的角色在我国商业化。本实验着眼于影响翠云草生长和叶色变化的各种因素的优化，得到了一组易于翠云草生长和其叶色显蓝的环境参数。

1 材料与试剂

实验所用翠云草于浙江省温州市雁荡山采集（北纬28°21′52″东经121°5′0″海拔200米左右），经由浙江中医药大学丁志山教授鉴定确为翠云草（Selaginella uncinnata）。本研究所用试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。实验器材包括立式压力蒸汽灭菌锅，型号YXQ-LS-100SII，购于上海博讯实业有限公司；pH计，实验室pH计 FiveEasy，购于Mettler Toledo；电热恒温水槽，型号DK-450B，购于上海森信实验仪器有限公司；分光光度计，型号Ultrospec 3300pro UV/Visible Spectrophotometer，购于Amersham Biosciences；冷冻离心机，购于Thermos Scientific；高效液相色谱，Ultimate3000；色谱柱，Acclaim 120 C18 5um 120A 4.6X250m

m，购于Dionex。

2 方法

2.1 培养条件对翠云草叶色的影响

采用恒温温室培养，温度控制为25±2℃；在翠云草生长期间保持培养基不干燥，保持叶片的湿润。在筛选最适激素实验中，选取长势良好、生长茂盛、有蓝绿色光泽且含一个不定根的翠云草茎分别培养在含不同激素的1/2 MS（pH 6.0）无糖培养基中（详见表1）。在5个实验周期间，每周观察两次其生长及叶色的变化，利用平行拍摄和Auto CAD软件对比分析其根长、株长的变化。

土壤实验中选择红土、黄土和泥炭土三种常见的观赏植物用土作为变量，在其它条件相同情况下培养，观察翠云草叶色的变化。

光质影响实验中采用不同波长的LED灯为光源，分别为红光（620-625nm）、橙光（585-590nm）、绿光（520-525nm）、蓝光（465-470nm）、白光（390-780nm）、无光源照射六个实验组，在其它条件相同情况下，培养观察叶色的变化。

2.2 叶绿素和翠雀素含量的测定

参考王二雷[7]测定蓝莓中翠雀素含量的方法，用高效液相色谱比积法测定翠雀素含量。采用80%丙酮提取翠云草中的叶绿素，含量测定方法参考2008年崔晓静的研究[8]。

2.3 PAL活性的测定

根据崔晓静研究中的方法测定PAL活性[8]，以L-苯丙氨酸（L-phe）为底物，翠云草叶片组织作为酶源，酶促生成产物反式-肉桂酸（t-Ca）测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的紫外分光光度法。

3 结果

3.1 激素对翠云草生长和叶色的影响

通过拍照和Auto CAD软件分析发现，0.2mg/L NAA、0.5mg/L KT及0.5mg/L 6-BA对翠云草根和植株均没有明显的促生作用，累计增长率未超过10%。并且在0.5mg/L 6-BA的影响下翠云草根部甚至出现负增长的现象。0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4能够显著促进翠云草根生长，累计增长26.33%（P<0.05），但对翠云草株长影响不大。0.2mg/L 2，4-D则对根和地上部分都有明显促增长作用，分别为13.48%和25.56%（P<0.05详见图1，2）。

六周后对翠云草的叶色进行对比观察，发现总体各组别叶色均没有显著变化。0.5mg/L KT和0.5mg/L 6-BA组叶片略显黄色，0.2mg/L NAA和0.2mg/L 2，4-D组较未处理组更绿，而0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4组未见变化。

3.2 土壤对翠云草的影响

在接下来的实验中我们以0.2mg/L 2，4-D 1/2MS培养液浇灌，分别以黑土、红土、泥炭土以及雁荡山当地土壤为基质进行对比实验。发现在不同的土质比较实验中，翠云草在黑土、红土和泥炭土条件下的生长情况无明显差异，因而仍采用雁荡山土质进行后续实验。（详见图3）

3.3 光质对翠云草生长和叶色变化的影响

在光质实验中，目测蓝光（465-470nm）和白光（390-780nm）照射下翠云草生长较迅速，在蓝光叶片变蓝。

3.3.1 叶绿素含量的定量分析

在实验前、后取不同组翠云草叶片，分别定量分析其中葉绿素a、b的含量，计算叶绿素a与b值（表3）。对比发现翠云草叶绿素a/b值为2.26±0.04，不同波长照射对叶绿素a、b含量影响不同。红光照射后叶绿素a含量降低而叶绿素b含量增加，叶绿素a/b值降到0.61。而蓝色光照射后两种叶绿素含量增加明显，叶绿素a/b值为1.05。作为对照，白光和无光照培养条件下叶绿素a/b值几乎不变。

3.3.2 翠雀素含量

在本实验以蓝莓中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、翠雀素-3-O-葡萄糖苷以及翠雀素-3-O-半乳糖苷为相对标准品。通过HPLC法对翠云草中翠雀素进行半定量分析，其中翠雀素-3-O-葡萄糖苷在不同光质照射下含量有所变化，如图4所示。

3.3.3 PAL活性

PAL是植物中催化酚类次生代谢产物合成的重要蛋白质，与翠雀素合成有关。在对该酶酶活性连续6周的跟踪测定中发现，红、蓝光对PAL活性有显著影响，PAL活性增长率超过300%，达到350U/g；而橙、白光对PAL活性影响不大，始终维持在100-200U/g；PAL活性在绿光和无光条件下明显降低（见图5）。

4 结束语

为保证有足够的实验材料，我们首先通过实验筛选出最适合翠云草生长的培养基配方和土壤基质，发现含0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4（pH6.0）的1/2 MS不含糖培养基对翠云草生根最为有利，而0.2mg/L 2，4-D能够同时促进翠云草根和地上部分生长。有实验证明0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4促翠云草生根的作用与其它蕨类植物作用相似[9-10]，2，4-D还能够诱导乌毛蕨[11]等蕨类植物形成愈伤组织，而激素、土质对翠云草叶色影响不大。

翠云草是一种阴生植物，叶片中叶绿素a/b的比值在2左右，能够更充分利用短波长的光，即蓝紫光。在光质实验中，对比分析叶绿素a、叶绿素b和花青素中的一种翠雀素的含量，发现经过蓝光照射三种叶绿素的含量均有增加，叶绿素b和翠雀素-3-O-半乳糖苷含量明显增加。张水木等[12]用不同颜色彩色膜和遮荫处理的室外光照条件下培养翠云草，发现翠云草在不同光质条件下色素苷的含量变化极明显，这与本实验结论一致，而叶绿素含量变化不明显，推测是由于培养条件不同导致。翠雀素是植物花色和叶色呈现蓝色的主要成分原因，PAL则是翠云草色素苷合成反应的首个关键酶，其活性的变化直接能改变翠云草叶色的变化。在蓝光照射下翠云草叶片中PAL活性也显著上升，增加3.5倍，而翠雀素-3-O-半乳糖苷含量变化不大（阴性结果未展示），推测可能是因为缺少翠雀素-3-O-半乳糖苷合成有关的底物或蛋白。

本研究对蓝色翠云草的室内培养条件进行了初步探索，为种植和推广该变色的观赏植物提供了实验依据。

参考文献：

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