DKK1对AGEs/TNF⁃α微环境牙周膜干细胞骨向分化能力的影响*

杨 琨，李 骏，丰奇昊，沈梦杰，陈谦谦，罗雅馨，刘 琪△（遵义医科大学附属口腔医院：.牙周科；.种植科，贵州遵义563000）

牙周炎作为全球性普遍发生的慢性炎性反应，能够导致牙龈、牙槽骨、牙骨质的牙周组织损伤，最终使牙齿出现松动及缺失[1]。牙周膜干细胞（PDLSCs）作为间充质干细胞（MSC）的一个特殊群体，目前已成为牙周组织缺损修复的重点研究对象[2]。研究表明，慢性牙周炎中获得的PDLSCs再生潜能会受到损伤[3]。对糖尿病伴牙周炎患者而言，牙周炎的严重程度以糖尿病进程之间密切相关，且牙周炎已经被认为是糖尿病的第六大并发症[4]。然而，目前研究中糖尿病伴牙周炎状态下的PDLSCs的相关生物学特性还尚未探究明白。

在学者的努力研究下，牙周炎和糖尿病两者相互关系正逐渐明朗。临床研究发现，在糖尿病患者的糖基化终末产物（AGEs）水平与健康患者具有明显差异[5]，且糖尿病患者中AGEs细胞膜受体的晚期糖基化终产物（RAGE）被配体AGEs激活，表达量升高。因此，在牙周炎及其他糖尿病并发症中，AGEs逐渐受到学者们的重视[6-8]。另有研究发现，抑制糖尿病小鼠的RAGE通路能够降低牙周炎相关骨吸收，还能降低牙龈组织中促炎性细胞因子的产生[9]。而提高RAGE的表达量，则会导致糖尿病患者牙周组织中炎性反应及组织损伤加剧，最终加速牙周的破坏[10-11]。此外，AGEs还能够通过抑制MSC的成熟，弱化MSC的分化能力从而阻止组织修复[12]，但是目前学者对AGEs-RAGE轴的整个机制仍然知之甚少。

DKK1作为Wnt通路的经典抑制剂，已广泛应用于成骨分化的研究[13]，其通过与Wnt受体结合，影响下游信号转导[14-15]。虽然有研究表明DKK1可以通过抑制Wnt/β-catenin通路从而抑制PDLSCs的成骨分化[16]，但本研究表明，在糖尿病伴牙周炎PDLSCs中的表达中，DKK1是被抑制的，而利用DKK1抑制Wnt通路则能调节RAGE的表达，逆转D-PDLSCs造成的骨向分化能力减弱。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 α-MEM培养基、胶原酶、胰蛋白酶购于Gibco公司；胎牛血清购于四季青公司；鼠抗人CD44、CD146、stro-1、CD90、CD271、CD45 单克隆抗体购于Abcam公司；重组人DKK1购于Abcam公司；AGEs-牛血清清蛋白（BSA）购于Bio Vision公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）购于 Peprotech 公司；细胞总 RNA 提取试剂盒、一步法采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒购于Takara公司；蛋白质及IP细胞裂解液购于Beyotime公司；BCA蛋白定量试剂盒购于Beyotime公司；Runx2一抗购于Abcam公司；Osterix一抗购于Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）鼠单克隆抗体购于Abcam公司；罗丹明山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）购于中杉金桥公司；山羊抗兔lgG购于Abcam公司；体视显微镜、倒置相差显微镜及照相系统购于OLYMPUS公司；流式细胞分析仪购于Beckmen Coulter公司；real time PCR仪器购于Applied Biosystems。

1.2 方法

1.2.1 人牙周干细胞培养和分离及表面分子鉴定 （1）取材和培养。选取在遵义医学院附属口腔医院就诊，18～25岁正畸而需拔除前磨牙者作为牙周膜组织获取主要对象。选择标准为：①口内余留牙不少于20颗；②身体健康，不吸烟，无糖尿病病史及家族史，血糖水平正常；③无消化、呼吸、生殖、泌尿等系统或身体其他部位的感染，无其他严重疾病。拔牙后生理盐水反复冲洗第三磨牙3次，转移至含有100 U/mL青霉素及链霉素0.1 mg/mL的α-MEM培养基中。磷酸缓冲盐溶液（PBS）反复冲洗牙根3次，超净台刮取根中1/3牙周膜组织，Ⅰ型胶原酶消化，10%胎牛血清的α-MEM中和离心，37 ℃、5%CO2恒温箱贴壁培养 PDLSCs。（2）流式细胞仪检测相关表面分子。通过检测 STRO-1、CD146、CD44、CD90、CD271、CD45 鉴定 PDLSCs。

1.2.2 RT-PCR 检测 Runx2、碱性磷酸酶（ALP）mRNA表达 3组PDLSCs细胞成骨诱导培养7 d后进行细胞收集，按TRIzol说明书抽提各组细胞总RNA，并用逆转录试剂盒合成cDNA。参照GenBank数据库，以Primer primer 5.0计算机软件设计引物；以β-actin为内参照，采用 RT-PCR 检测，反应体系为：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各 0.5 μL、样本模板2 μL；反应条件参照产品说明。试验重复3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列见表1。

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blotting）检测RUNX2及Osterix蛋白表达 取骨诱导14 d后的各组细胞，用Western及IP细胞裂解液进行总蛋白提取；用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量测定；十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE），转膜，封闭，免疫反应；最后进行化学发光反应检测各组RUNX2及Osterix蛋白的表达，用IPP 6.0软件对其灰度值进行定量分析。

1.2.4 ALP活性和矿化结节形成量分析 诱导培养7 d，取各组细胞分别用ALP试剂盒对各组细胞进行染色；28 d取各组细胞进行茜素红染色。

1.3 统计学处理 使用SPSS 11.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验。检验水平值α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PDLSCs原代培养与传代培养 见图1。

2.2 PDLSCs表面标志物检测 流式细胞仪检测第三代 PDLSCs表面标志物 STRO-1、CD146、CD44、CD90、CD271（CD271/P75NTR已作为MSC来源的细胞表面标志物）[17]，其阳性率分别为 12.4%、57.7%、99.1%、95.8%、8.46%，CD45为阴性表达。

表1 引物基因序列

图1 PDLSCs原代培养与传代培养图

2.3 PDLSCs成骨能力受损情况 ALP与茜素红染色表明，与PDLSCs组比较，AT-PDLSCs组成骨能力明显降低。见图2。

图2 各组ALP染色及茜素红染色图

2.4 DKK1逆转 AGEs/TNF-α对 PDLSCs成骨的影响 RT-PCR表明，D+AT-PDLSCs组骨向分化标志基因Runx2、ALP水平表达高于AT-PDLSCs组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western blotting检测发现，D+ATPDLSCs组Runx2、Osterix水平表达也高于AT-PDLSCs组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 3、4。

图3 RT-PCR检测各组Runx2、ALP的mRNA表达量

图4 Western blotting检测各组Runx2、Osterix蛋白表达量

3 讨 论

PDLSCs具有能再生牙周组织的干性。前期研究中已证实PDLSCs能够在牙周缺损的治疗中起重要作用[18-19]。本研究旨在探讨糖尿病伴牙周炎微环境对PDLSCs成骨能力的影响。AGEs抑制了PDLSCs的成骨潜能，并且协同TNF-α产生糖尿病伴牙周炎炎性微环境，进一步抑制PDLSCs的成骨能力。

研究表明，PDLSCs能够修复牙齿支持复合部件（牙周膜、牙槽骨、牙骨质）[20]，在牙周炎发生、发展过程中起重要作用。前期研究中，作者已证实炎性反应对PDLSCs的影响，作者希望探究单纯牙周炎和全身疾病伴发的牙周炎对PDLSCs的影响是否一致。有学者研究表明，不同年龄来源的H-PDLSCs与P-PDLSCs特性不同[3，21]，并发现 DKK1 对 H-PDLSCs与 P-PDLSCs都存在相同的影响。DKK1可能逆转P-PDLSCs受损的成骨潜能。

近年来，AGEs与糖尿病及其伴发性疾病的关系受到关注[7]，本课题组针对AGEs对PDLSCs生物学性能的影响也进行了大量研究[22-25]。然而，Wnt/β-catenin信号通路与多种疾病的发病机制相关。研究表明，Wnt信号是糖尿病的主要调节点[26-28]，但Wnt信号通路在糖尿病伴牙周炎发生、发展中的作用尚不清楚。本研究中，体外试验表明DKK1可促进AT-PDLSCs成骨分化，而试验中也能发现DKK1可促进H-PDLSCs的矿化。但该结果相对于其他试验组缺少某些稳定性，这可能与微环境对PDLSCs克隆形成的影响有关。PDLSCs属于MSC一类，研究表明Wnt/β-catenin信号通路能够促进MSC的成骨分化[29-30]。也有研究表明，高水平的Wnt3a处理则会抑制MSC的成骨分化[31-32]。本课题组也发现，Wnt通路在骨髓来源MSC和牙周膜来源MSC的作用恰恰相反，在两者中可能会出现不同的炎性反应影响[33]。Wnt3a和 LiCl能够激活 Wnt/β-catenin 信号通路，抑制牙周组织来源MSC的成骨分化能力[34]。作者推测，这可能是由于PDLSCs是牙周组织中的另一种MSC，并且可能与不同克隆形成来源有关。因此，Wnt信号通路对MSC中成骨细胞分化能力是激活还是抑制尚待进一步研究。

综上所述，AGEs/TNF-α模拟糖尿病伴牙周炎微环境的PDLSCs功能受损。Wnt信号通路抑制剂DKK1处理后表现出骨形成能力的提升，可能部分源于AGEs-RAGE轴的调控，相关机制可能涉及AGEs诱导的PDLSCs功能失调。目前研究的最终目的是修复糖尿病伴牙周炎的牙周组织缺损，而Wnt信号通路的调控能够促进PDLSCs生物学性能，DKK1或者某些小分子化合物能够促进PDLSCs骨向分化潜能，故可将其作为修复糖尿病伴牙周炎牙周缺损治疗中的重要因子。