高钙菜茎总黄酮提取及抗氧化活性研究

◎ 李艳红，彭 伟，侯斯晋

（绵阳市产品质量监督检验所，四川 绵阳 621000）

高钙菜含有丰富的蛋白质、钙、磷、铁等矿物质元素，胡萝卜素、维生素B等营养素[1]，以及生物碱、黄酮类化合物、β-谷甾醇、没食子酸等功能因子[2-3]，具有较好等抗氧化性、抗炎症、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等生物活性[4]。目前，国内关于高钙菜的研究报道主要集中在高钙菜叶化学成分的分析、高钙菜总黄酮的提取工艺研究、高钙菜总黄酮的分离纯化以及抗氧化活性研究[5-7]，而且原料大多来自华东、华中、华南（如安徽、湖北）等地。由于高钙菜除了嫩尖，还有大量的茎，尤其是在大量种植未及时采摘，由于高钙菜生长旺盛，会有大量茎产生，单纯丢弃会造成资源大量浪费。本文主要研究高钙菜茎总黄酮的提取与抗氧化活性，以期为合理利用该部分资源提供一定的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高钙菜，2017年8月采自西南科技大学蔬菜实验园，新鲜，无虫害。

试剂：芦丁对照品，南京替斯艾么中药研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、2,2-联氮-二(3-乙基 -苯并噻唑 -6-磺酸 )二铵盐（ABTS），SIGMA ALDRICH公司；乙醇、等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

U-3900H型紫外分光光度计，Hitachi日立公司；Agilent1200 系列LC-MS；RE-52A 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；冷冻真空干燥仪，Thermo Electron Corporation。

1.3 试验方法

1.3.1 高钙菜茎总黄酮提取工艺

高钙菜→去叶留茎→清洗→沸水烫漂30 s→55 ℃烘干→粉碎→过60目筛，作为样品原料→总黄酮提取（料液比1∶50，提取温度85 ℃，提取时间4 h，乙醇浓度80%）→离心（4 500 r/min，15 min）→上清液备用。

1.3.2 总黄酮测定与得率计算

1.3.2.1 标准曲线绘制

以芦丁标准品为对照，采用NaNO2-Al(NO3)3法[8]测定总黄酮含量，以芦丁含量为横坐标，吸光值为纵坐绘制标准曲线，以浓度对吸光值进行回归，计算回归方程。根据标准曲线计算所得回归方程为y=1.000 6x+0.006，相关系数R2=0.999 8，x为芦丁标准液浓度（mg/mL），y为吸光度。

1.3.2.2 样品总黄酮含量测定

取总黄酮待测液1.0 mL于25 mL具塞试管中，按照标准曲线方法加入待测试剂并测定吸光值，根据标准曲线计算总黄酮得率。

1.3.3 总黄酮抗氧化活性研究

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

以无水乙醇作为参比，参考Helal A等[9]的方法，并略加修改。向比色管中依次加入1 mL不同浓度样液、2 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，摇匀，室温黑处静置30 min，在517 nm处测定不同时间各浓度样品溶液的吸光值Ai；分别以等体积去离子水代替DPPH自由基和样品溶液，分别测定吸光值Aj和Ac。按下式计算DPPH·清除率（K）。

1.3.3.2 超氧阴离子自由基清除活性

参照邻苯三酚自氧化法[9]，并略加修改。在0～180 s内，每30 s在波长319.5 nm处测定一次吸光值。将测量值带入式（2）计算：

式（2）中：∆Ai是加入样品溶液吸光值随时间的变化率；∆Aj是不加显色剂溶液体系吸光值随时间的变化率；∆Ac是不加样液溶液体系的吸光值随时间的变化率。

1.3.3.3 ABTS阳离子自由基清除活性

参考Helal A等[9]的方法，并略加修改。在25 mL比色管中依次加入40 μL不同浓度试样及4 mL ABTS阳离子自由基（ABTS+·）测定液，摇匀，准确反应10 min，于734 nm处测定吸光值Ai。以去离子水代替ABTS+·测定液，测定Aj，再以去离子水代替样液，测定Ac。

1.3.4 数据统计与分析

每组实验重复3次，结果均以平均值±标准差（X±SD）表示，作图主要由Excel2013软件完成。

2 结果与分析

2.1 高钙菜总黄酮得率

在料液比1∶50，提取温度85℃，提取时间4 h，乙醇浓度80%条件下，高钙菜茎总黄酮得率（1.64±0.12）%。

2.2 DPPH自由基清除活性

高钙菜茎总黄酮、丁基羟基茴香醚（BHA）和VC对DPPH·的清能力结果，如图1所示。

图1 总黄酮对DPPH·的清除活性图

由图1可知，高钙菜茎总黄酮和VC对DPPH·的清除率均高于BHA。在实验范围内，当抗氧化剂浓度在38.4 μg/mL以下时，茎总黄酮对DPPH·的清除率几乎呈线性变化，当浓度继续增加时，DPPH·清除率增幅平缓接近于100%。茎总黄酮、BHA、VC清除DPPH·的 IC50值分别为 15.67 µg/mL、40.80 µg/mL、14.43 µg/mL，3种试样清除DPPH·能力大小排序为：VC＞茎总黄酮＞BHA。说明高钙菜茎总黄酮对DPPH·有良好的清除作用，与VC能力相当。

2.3 超氧阴离子自由基清除活性测定

高钙菜茎总黄酮、BHA和VC对超氧阴离子自由基清能力结果，如图2所示。

图2 不同抗氧化剂对超氧阴离子自由基清除活性图

由图2可知，随着试样浓度的增大，3种抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除率逐渐升高，但VC对超氧阴离子自由基清除率快速增加至100%，而茎总黄酮和BHA对超氧阴离子自由基清除率增幅较小，在221 µg/mL时，茎总黄酮对超氧阴离子自由基清除率接近于BHA；茎总黄酮、BHA、VC清除超氧阴离子自由基的 IC50值分别为：117.01、144.91、55.65 µg/mL，超氧阴离子自由基清除能力大小依次为VC＞茎总黄酮＞BHA。说明高钙菜茎总黄酮对超氧阴离子有较好的清除作用。

2.4 ABTS+自由基清除活性测定

高钙菜茎总黄酮、BHA和VC对ABTS+自由基清能力结果，如图3所示。

图3 不同抗氧化剂对ABTS+自由基清除活性图

由图3可知，随着试样浓度的增大，3种抗氧化剂对ABTS+自由基的清除率呈线性增加，茎总黄酮清除ABTS+自由基能力在各个浓度下均高于VC和BHA，茎总黄酮、BHA、VC清除ABTS+自由基的IC50值分别 为：125.87 µg/mL、175.20 µg/mL、221.29 µg/mL，3种试样对ABTS+自由基清除能力强弱顺序为：茎总黄酮＞BHA＞VC。说明茎总黄酮对ABTS+自由基有良好的清除作用。

3 结语

高钙菜茎总黄酮得率为（1.64±0.12）%。当高钙菜茎总黄酮浓度在38.4 μg/mL以上时，高钙菜茎总黄酮对DPPH自由基清除能力与VC相当，达100%，明显高于BHA；随着试样浓度的增大，VC对超氧阴离子自由基清除率快速增加至100%，而茎总黄酮和BHA对超氧阴离子自由基清除率增幅较小，在浓度为221 µg/mL时，茎总黄酮对超氧阴离子自由基清除率接近BHA，达74.29%；VC、BHA和茎总黄酮随着试样浓度的增加对ABTS+自由基的清除率呈线性增加，茎总黄酮清除ABTS+自由基能力在各个浓度下均高于VC和BHA。