三种中国传统干腌火腿中粗多肽的 抗氧化与抑菌活性的比较

郑锦晓,邢路娟,周光宏,张万刚

(肉品加工与质量控制教育部重点实验室,江苏省肉类生产 与加工质量安全控制协同创新中心,南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

金华火腿、宣威火腿和如皋火腿并称为中国三大传统干腌火腿。干腌火腿历史悠久,具有丰富的营养价值[1]。干腌火腿加工时间一般长达8～10个月,三种传统干腌火腿都经历了原料腿选择、修整、腌制、洗腿、晒腿、发酵和成品阶段,但腌制环境、发酵成熟时间和温度等条件不同,产生的活性肽的活性可能存在差异[2-4]。在火腿加工过程中,火腿中的蛋白质在内源蛋白酶的作用下，发生水解而产生大量的多肽、小肽和氨基酸等[5]。Sforza等[6]研究表明,帕尔玛火腿中含有大量小分子多肽。生物活性肽是指除其基础的营养功能外,还可在生物体内起重要的生理功能作用,发挥特定生理功能的肽类物质[7]。活性肽在体内的消化吸收性能明显优于单个氨基酸[8]。目前人们已从酪蛋白[9]、大豆蛋白[10]、胶原蛋白[11]中提取得到活性肽。据研究表明,干腌火腿中都存在生物活性肽,其具有抗氧化、降血压、抑菌等活性。Zhu等[12]研究了金华火腿粗多肽的抗氧化活性,发现火腿中氨基酸序列为GKFNV的多肽起主要抗氧化作用。Xing等[13]在宣威火腿中发现粗多肽具有较高的抗氧化活性,并对进行分离纯化,鉴定出具有较高抗氧化活性的肽段 DLEE。Castellano等[14]对西班牙干腌火腿粗肽进行分离并测定其抑制李斯特菌的能力,得到具有较好抑菌能力的肽段RHGYM。此外,Escudero[15]等对西班牙干腌火腿多肽进行肾素抑制率的测定,发现小于1700 Da的小肽具有更强的降血压活性。因而,传统干腌火腿生物活性肽的研究主要集中于抗氧化与降血压活性,分别涉及国内金华火腿、宣威火腿及国外干腌火腿等,而在抑菌方面,未见有国内干腌火腿多肽抑制微生物能力的研究。

关于中国三种传统干腌火腿抗氧化活性及抑菌活性的比较分析还未见报道,因此本研究以金华火腿、宣威火腿、如皋火腿粗多肽作为研究对象,通过测定火腿抗氧化活性及抑菌活性,结合盐含量及粗多肽氨基酸成分分析结果,比较三大火腿抗氧化和抑菌活性的差异,为进一步探究火腿提取物生物活性功能的机理研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金华火腿 浙江金华市金年火腿食品有限公司;宣威火腿 云南省宣威市浦记火腿食品有限公司;如皋火腿 江苏长寿集团,均选取经过成熟发酵1年后的后腿部分,每种火腿随机选取6块,取股二头肌部分进行实验,并于4 ℃下保存;大肠埃希氏菌(Escherichiacoli) 中国微生物菌种保藏管理中心(No:21530);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司;ORAC抗氧化试剂盒 美国Cell Biolabs公司;总抗氧化(ABTS法)试剂盒、总抗氧化(FRAP法)试剂盒 碧云天生物技术有限公司;其他常用溶剂 均为国产分析纯。

GM200刀式研磨仪 德国Retsch公司;T25匀浆机 德国IKA公司;冷冻干燥机德国 Christ公司;Spectral Max M2e多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;UV-2450 日本岛津公司;TG16-WS台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;Mili-Q超纯水系统 美国Milipore公司;Baker SG403A生物安全柜 美国Baker公司;Hitachi L-8900A氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 火腿含盐量的测定 按照GB/T 9695.8-2008《肉与肉制品 氯化物含量测定》规定,采用Volhard法测定火腿中盐的含量。利用热水提取火腿肉中的氯化物,沉淀蛋白质,过滤后将滤液酸化,加入过量的硝酸银,以硫酸铁铵为指示剂,用硫氰酸钾标准溶液滴定过量的硝酸银,计算出氯化钠的含量。取10 g肉样品加入到100 g水中,并置于沸水浴中15 min,待冷却至室温,依次加入2 mL亚铁氰化钾溶液(106 g溶于1000 mL水中)与2 mL二水乙酸锌溶液(220 g溶于30 mL冰乙酸,定容于1000 mL水中),静置,过滤,吸取20 mL 滤液加入5 mL稀硝酸和1 mL硫酸铁铵溶液作为指示剂,再加入20 mL硝酸银标准溶液(0.1 mol/L),3 mL 壬醇,充分混匀,用硫氰酸钾溶液(0.1 mol/L)滴定,直至出现稳定的粉红色,记录体积。

式(1)

式中:V2指空白实验消耗体积数;V1指样品测定中消耗体积数;C指硫氰酸钾标准溶液的浓度。

1.2.2 粗肽粉的提取 参照王娟等[16]的方法并稍作修改。取股二头肌的火腿成品25 g,经研磨仪绞碎成渣后放入离心瓶,加入100 mL磷酸缓冲溶液(pH为7.2),匀浆(22000 r/min)3次,每次10 s。在4 ℃条件下静置2 h,静置后离心(4 ℃,12000×g,20 min),吸取上清液,加入3倍体积的乙醇(v∶v,40%),静置12 h。再次离心(4 ℃,12000×g,20 min)。冷冻干燥后,在分析测试前将样品保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.3 粗肽粉的肽含量的测定 参照Church等[17]的方法,将粗肽粉分别配制成质量浓度为0.5、1.0、5.0 mg/mL的粗肽液,取40 mg邻苯二甲醛溶于1.0 mL甲醇,依次加入25 mL 100 mmol/L硼砂,2.5 mL 20%(w/w)十二烷基硫酸钠和100 μLβ-巯基乙醇,用超纯水定容为50.0 mL,配制成邻苯二甲醛混合液;取150 μL待测样品与3.0 mL邻苯二甲醛混合液混合,在室温下精确反应2 min,用酶标仪测定其在340 nm波长下的吸光值。并以胰酪蛋白胨作为标准蛋白,配制等梯度浓度的溶液,测定其吸光值,绘制胰酪蛋白胨标准曲线(Y=0.4381x+0.1295,R2=0.9932)后，计算三种火腿提取物中肽的含量。

1.2.4 氨基酸成分分析 取冷冻干燥后样品进行氨基酸成分分析,参照Dong等[20]采用氨基酸自动分析仪进行测定。肽液用6 mol/L盐酸水解24 h(110 ℃),然后将水解液蒸干,用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成的测定。

1.2.5 清除DPPH自由基的能力 清除DPPH自由基能力的测定参照Orban等[18]的方法并作修改。将三种火腿粗肽液分别配制成质量浓度为1.0～5.0 mg/mL的肽液,并取1 mL待测肽液与1 mL浓度为0.2 mmol/L的无水乙醇 DPPH溶液混合,振荡混匀,在室温下放置30 min,测定反应物在517 nm波长下的吸光度值,记为A1;1.0 mL浓度为0.2 mmol/L的 DPPH无水乙醇溶液与1.0 mL无水乙醇混合物反应记为对照组A2;空白组为1.0 mL肽液与1.0 mL 无水乙醇混合,记为A0。DPPH自由基的清除率计算如下:

式(2)

式中:空白组为A0;实验组为A1;对照组为A2。

1.2.6 铁离子还原能力(FRAP) 铁离子还原能力的测定,参照碧云天总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP)说明书。

1.2.7 清除ABTS+自由基能力 清除ABTS+自由基能力的测定,参照碧云天总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS)说明书。

1.2.8 氧自由基吸收能力(ORAC) 氧自由基吸收能力的测定,详见Cell Biolabs总抗氧化试剂盒(ORAC)说明书。

1.2.9 大肠杆菌抑制能力 首先对粗肽液进行超滤处理,截留分子量为3 KDa以下的肽液进行冻干。参考张顺亮等[19]的研究方法,测定大肠杆菌的抑菌活性,以抑菌率表示。将菌种培养至对数生长期并用无菌生理盐水进行稀释,浓度调整为1.0×106CFU/mL,按照1∶4 (V∶V),吸取细菌培养液500 μL至2 mL无菌PBS中,为对照组。实验管中加入500 μL细菌培养液与2 mL经0.22 μm无菌滤膜过滤的多肽溶液,同时振荡培养(37 ℃ 150 r/min 1 h),之后对菌液进行梯度稀释,取100 uL涂布于计数平板上,37 ℃培养24h,计算菌落总数。计算公式如下:

抑菌率(%)=(N0-N1)/N0

式(3)

式中:N0为对照管细菌菌落总数;N1为实验管细菌菌落总数。

1.3 数据处理与统计分析

实验结果用平均值±标准差表示。方差分析采用SAS 8.0中one-way ANOVA来分析,通过Duncan’s Multiple-Range Test比较单个均值之间的差异性(p<0.05),实验重复数为6。

2 结果与分析

2.1 三种干腌火腿的氯化钠含量与肽含量

表1列出了三种干腌火腿氯化钠含量和通过磷酸盐法提取的粗多肽中肽的含量。由表1可知,氯化钠含量方面,如皋火腿含量最高,金华火腿次之,宣威火腿含量最低(p<0.05)。肽含量方面,宣威火腿显著高于如皋火腿(p<0.05)。盐含量的高低和肽含量的多少与火腿生产环境和发酵成熟的工艺密切相关。火腿中的矿物质离子主要是钠离子,其可赋予火腿以咸味,火腿中的食盐含量和火腿的pH会影响火腿的咸度,火腿中的食盐含量与腌制用盐量、腌制方法及腌制条件等因素有关[21]。除用盐量存在差异外,三种干腌火腿上盐时间也存在差异,宣威火腿和金华火腿上盐时间1个月,而如皋火腿上盐时间长达2个月[3-4,22],致使如皋火腿含盐量高于其他两种干腌火腿。此外,干腌火腿内源蛋白酶活性的强弱,发酵时间的长短也会影响火腿粗多肽的生成,内源酶的活力受限于温度、pH及盐分的高低等,盐含量越高,酶的活力会降低,这也可能是导致宣威火腿中粗多肽的肽含量显著高于金华火腿和如皋火腿的原因。

表1 三种干腌火腿粗多肽氯化钠含量及肽含量Table 1 Salt content and peptide content of crude peptide from three dry-cured hams

2.2 三种干腌火腿中粗多肽氨基酸成分分析

由表2可知,通过磷酸盐提取法获得的三种干腌火腿粗多肽中Glu、Asp、Arg和Lys的含量较高,均超过2.0 g/100 g,其中Glu含量最高,约占干腌火腿水解氨基酸总量的1/6。赵改名等[21]的研究表明干腌火腿中含有丰富的Glu和Lys等氨基酸,这与本实验结果一致。通过三种干腌火腿粗多肽中相同氨基酸含量的比较可知,宣威火腿粗多肽中Pro和Thr的含量显著高于其他两种火腿,金华火腿粗多肽中His和Arg的含量显著高于其它两种火腿(p<0.05);宣威火腿与如皋火腿粗多肽中Asp和Trp的含量显著高于金华火腿(p<0.05);宣威火腿与金华火腿粗多肽中Phe的含量显著高于如皋火腿(p<0.05);金华火腿与如皋火腿粗多肽中Glu的含量显著高于宣威火腿(p<0.05);宣威火腿粗多肽中Ser的含量显著高于金华火腿(p<0.05),宣威火腿粗多肽中Val、Gly及Ile的含量显著高于如皋火腿(p<0.05),如皋火腿粗多肽中Thr的含量显著高于金华火腿(p<0.05)。而三种火腿粗多肽中Ala、Met、Leu及 Lys的含量没有显著差异(p>0.05)。

生物活性肽的活性功能与其一级结构和氨基酸的组成密切相关[23]。有研究表明,ACE抑制肽末端氨基酸多含有Tyr和Pro等[24],而抗氧化肽的活性大小主要与肽序列中的疏水性氨基酸、酸性氨基酸、抗氧化性氨基酸及肽分子结构有关[25]。抑菌肽的活性主要受序列中的疏水性残基影响,如Ala、Leu或Trp等[26]。对比表中疏水氨基酸的含量可知,宣威火腿粗多肽中Leu、Val、Pro、Ala和Trp、Tyr、Phe疏水性氨基酸的总含量为8.06 g/100 g,显著高于如皋火腿粗多肽(6.93 g/100 g)和金华火腿粗多肽(6.68 g/100 g)(p<0.05)。疏水性氨基酸残基越多,能够促进多肽与生物体内脂质的结合,增强抗氧化活性[27]。如皋火腿粗多肽Asp和Glu(酸性氨基酸)的含量(6.41 g/100 g)与金华火腿粗多肽(5.98 g/100 g)无显著差异(p>0.05)。如皋火腿粗多肽Trp、Tyr、Met和His(抗氧化氨基酸)的含量(3.26 g/100 g)与宣威火腿(3.44 g/100 g)和金华火腿(3.11 g/100 g)没有显著差异(p>0.05)。这些抗氧化氨基酸如Lys和His,以单个氨基酸形式存在时也具有一定的抗氧化活性,但其活性往往低于以肽段组成的抗氧化肽[28]。

抑菌肽的分子量一般小于7000 Da,在肽的N端通常含有较多的碱性氨基酸,如Lys和His等[29],三种火腿粗多肽Lys的含量没有显著差异(p>0.05),金华火腿粗多肽中His的含量显著高于宣威火腿和如皋火腿(p<0.05)。而抑菌肽的C端氨基酸通常呈中性和疏水性,含Ala和Val等非极性氨基酸,中间部分则富含Pro[30]。表2中可知,宣威火腿粗多肽Val的含量显著高于如皋火腿(p<0.05)。

表2 三种干腌火腿粗多肽氨基酸成分分析Table 2 Amino acids composition analysis of three crude peptides

2.3 三种干腌火腿粗多肽抗氧化能力的比较

图1显示三种粗肽液在不同浓度下清除DPPH自由基能力的实验结果。通过图1可知,三种干腌火腿粗多肽都具有一定的DPPH自由基清除能力,且随浓度的升高清除能力逐渐增强。宣威火腿粗肽液在1.0 mg/mL的浓度下,清除DPPH自由基能力显著高于其他两种粗肽液,在2.0 mg/mL时,宣威火腿粗多肽的清除能力显著弱于其他两种粗多肽(p<0.05),在3.0和4.0 mg/mL时,三种粗多肽清除能力没有显著差异(p>0.05)。DPPH法的原理是测定抗氧化物提供氢原子给DPPH自由基以猝灭自由基的能力[25]。干腌火腿粗多肽中含有Trp和Tyr具有很好的供氢能力,可将氢原子提供给自由基,从而形成苯氧自由基和吲哚自由基等稳定的中间产物,减慢或停止自由基链式反应[31]。结合表2中氨基酸成分分析,宣威火腿疏水性氨基酸含量最多,使得宣威火腿粗肽液在1.0 及5.0 mg/mL 的浓度下,清除效果最好。此外,三种火腿都含有一定量的Trp和Tyr,宣威火腿粗多肽的Trp和Tyr含量显著高于金华火腿(p<0.05),在一定程度上可以解释宣威火腿粗肽液的DPPH自由基清除效果强于金华火腿。

图1 不同质量浓度粗肽液清除DPPH自由基的能力Fig.1 The effect of different concentrations of crude peptides on the DPPH radical scavenging abilities注:不同字母表示相同质量浓度下不同粗多肽 之间有显著差异(p<0.05);图2同。

图2 不同质量浓度粗肽液抑制大肠杆菌的能力Fig.2 The effect of different concentrations of crude peptide on the inhibitory of Escherichia Coli

表3列出了三种火腿粗多肽铁离子还原能力、ABTS+自由基清除能力和氧自由基清除能力的实验结果。ABTS+自由基清除能力和氧自由基清除能力是测定清除自由基能力的常用指标,铁离子还原能力是测定抗氧化剂的还原能力常用的方法[32]。结合三种抗氧化方法分析三种火腿粗多肽的抗氧化能力可知,宣威火腿粗多肽抗氧化能力最强,显著高于金华火腿及如皋火腿粗多肽(p<0.05)。金华火腿粗多肽氧自由基清除能力及铁离子还原能力显著高于如皋火腿粗多肽(p<0.05),而如皋火腿粗多肽ABTS+自由基清除能力与金华火腿粗多肽无显著差异(p>0.05)。短肽中特定氨基酸的组成,为粗肽液提供了较强的抗氧化能力。由表2可知,火腿粗肽液中含有的Cys是一种良好的巯基亲核试剂,具有捕获自由基的能力,His中的咪唑基具有供氢能力,能螯合金属离子和碎灭活性氧自由基而达到抗氧化效果[33]。

结合表2与表3分析可知,宣威火腿特定氨基酸含量,如疏水性氨基酸含量,某些抗氧化氨基酸(Trp、Tyr、Met)含量较高,使得宣威火腿粗肽液自由基清除能力最强。另外,金华火腿粗多肽His与Cys的含量显著高于如皋火腿(p<0.05),而如皋火腿粗多肽中Trp的含量显著高于金华火腿(p<0.05)。这些特定氨基酸的种类及数量导致了三种干腌火腿粗多肽抗氧化活性的差异,而目前对抗氧化肽的构效关系和复杂的作用机制尚未完全清楚,多肽的抗氧化活性还可能受肽链的长度、末端氨基酸组成及周围环境的影响[25]。因此,三种抗氧化指标中只有铁离子还原能力与氧自由基清除能力上显示金华火腿粗肽液清除效果显著强于如皋火腿(p<0.05),而ABTS+自由基清除能力上,如皋火腿粗多肽的清除效果与金华火腿粗多肽无显著差异(p>0.05)。

2.4 三种干腌火腿中粗多肽抑制大肠杆菌能力的比较

图2列出了三种干腌火腿中3000 Da分子量以下的粗肽抑制大肠杆菌的效果。由图2可知,抑制大肠杆菌的能力随着肽浓度的升高而增大,在0.5 mg/mL时,如皋火腿粗肽液抑菌能力显著弱于其他两种(p<0.05),在1.0、1.5 mg/mL时,宣威火腿与如皋火腿粗肽液的抑菌能力显著强于金华火腿粗肽液(p<0.05),三种粗肽液在2.0 mg/mL时没有显著差异(p>0.05),且抑制率接近100%。粗多肽抑菌效果也与氨基酸组成与含量密切相关,尤其受疏水性氨基酸的影响。有研究表明,抗菌肽平均长度为18个氨基酸残基[34],大肠杆菌(E.coli)结构简单,细胞壁是由一层肽聚糖构成,粗肽液中的肽段可能通过复杂的机制抑制靶细胞壁组分的合成或是破坏细胞壁结构,从而抑制大肠杆菌的生长[35]。除了具有疏水性氨基酸,抑菌肽中还富含Pro[36]。从表2中可以看出宣威火腿粗多肽Pro含量显著高于其他两种火腿(p>0.05)。此外,抑菌肽中还具有丰富的Arg,已知猪的 PR-39抗菌肽和牛抗菌肽中均富含有此类氨基酸[37]。金华火腿粗多肽中Arg的含量显著高于如皋火腿粗多肽(p>0.05),这可能是导致金华火腿粗肽液在1.0、1.5 mg/mL时抑菌活性高于如皋火腿粗多肽的原因。

3 讨论与结论

三种传统干腌火腿加工过程都经历了修割、上盐、腌制、洗腿、晒腿、成熟等阶段,其中,成熟阶段是火腿风味物质形成的重要时期。适宜的温度与湿度有助于火腿的成熟,火腿的内源蛋白酶降解蛋白质产生肽物质。宣威火腿的加工地点在云南,春秋季长,干季气候特征结合,且临近夏季相对湿度的上升,相较浙江、江苏地区纬度更低,加工环境的气候条件更适宜,平均室温在15～20 ℃之间,相对湿度在72%～80%之间,高于金华火腿发酵时期(相对湿度在55%～75%),可促进酵母菌和青霉菌、曲霉菌、木霉菌等霉菌的生长,加速腿内蛋白质和脂肪等成分的水解和转化,使火腿蛋白降解产生的肽物质更多,其中含有的特定疏水性氨基酸残基数量多,使宣威火腿多肽抗氧化及抑菌效果最好,关于其抗氧化及抑菌活性的内在机制有待进一步研究。

通过对宣威火腿、金华火腿、如皋火腿的氯化钠含量、粗多肽的肽含量、抗氧化活性、抑菌活性分析和氨基酸成分分析可知,受加工环境条件的影响,导致宣威火腿粗肽含量高,疏水性氨基酸Leu、Val、Pro、Ala、Trp、Tyr和Phe的含量显著高于其他两种干腌火腿(p<0.05);氯化钠含量最低,铁离子还原能力和ABTS+自由基清除能力、氧自由基清除能力最强,并且有抑制大肠杆菌,也有一定的清除DPPH自由基的能力。