蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实抗氧化能力的影响

方 芳

(上海食品科技学校,上海 201599)

籽粒苋(AmaranthushypochondriacusL.)是苋科(Amaranthaceae)、苋属(Amaranthus)一年生草本植物[1],是世界上最古老的作物之一[2]。它曾经是古代印第安人的主食之一,现已广泛种植于中美洲、亚洲和欧洲[3]。籽粒苋是一种营养价值很高,并兼备粮、菜、饲料、观赏等多种用途的作物[4]。籽粒苋产籽量高,籽实富含蛋白质、不饱和脂肪酸和维生素等。此外,它还含有多种生理活性成分,如多酚、黄酮等[5-6]。

蒸汽爆破技术作为一种经济、有效、无污染的前处理方式,目前已经广泛用于处理植物原料,如木质素[7]、麦麸[8]、大蒜[9]、竹茎[10]等。它的基本原理是,在高温高压环境下,过热液体充满原料孔隙,当瞬间释放压力,液体迅速气化,原料体积急剧膨胀而使细胞“爆破”,小分子物质从细胞内释放[11]。汽爆后,纤维素和半纤维素呈现不同程度的降解,有利于结合态酚酸的释放。龚凌霄[11]、刘翀[12]、赵梦丽[13]等均发现蒸汽爆破有利于原料酚酸释放和抗氧化能力的提高。

籽粒苋籽实作为一种优质的粮食来源,应用前景广阔。目前,尚未有关于籽粒苋籽实蒸汽爆破处理后,研究其活性成分及抗氧化能力的报道。本文探索了蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实抗氧化活性成分及抗氧化能力的影响,为充分有效地利用籽粒苋籽实资源提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

籽粒苋籽实 品种R104,收获于2017年8月,购于上海牧良实业有限公司;Folin-酚试剂 纯度>98%,华东医药股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 纯度>98%,源叶生物科技有限公司;2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)、2,4,6-三吡啶三吖嗪(TPTZ) 纯度>98%,青岛美伦生物科技有限公司;芦丁、对羟基苯甲酸、硫酸亚铁 纯度>98%,上海阿拉丁试剂有限公司;硝酸铝、亚硝酸钠、过硫酸钾 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

QBS-80型蒸汽爆破机 河南鹤壁正道生物能源有限公司;QE-100型屹立牌粉碎机 武义县屹立工具有限公司;Bio Tek EON型酶标仪 美国博腾(BioTek)仪器有限公司;HH-ZK6型恒温水浴锅 郑州长城科工贸有限公司;3K15型台式冷冻离心机 德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 籽粒苋籽实蒸汽爆破预处理 籽粒苋籽实采后自然风干,用蒸馏水浸泡5 h,一部分放入蒸汽爆破机物料仓中,通入饱和蒸汽,压力选取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 MPa,时间选取10、20、30、60、120 s,在极短的时间内完成泄压(阀门打开时间0.00875 s),实现蒸汽爆破[14];另一部分未作处理,为空白对照。将处理后的样品收集,自然风干,置于避光通风处,待分析。

1.2.2 籽粒苋籽实提取液制备 将上述籽粒苋籽实样品粉碎,过80目筛,精密称取1.0000 g粉末于50 mL三角瓶,按照料液比1∶30 (w/w)比例加入50%乙醇,70 ℃水浴搅拌浸提30 min,将提取液冷却,4800 r/min离心10 min,提取上清液,待测。

1.2.3 总酚含量测定 参考方芳[15]方法并稍作调整。准确称取经0.1 MPa,70 ℃真空干燥至恒重的对羟基苯甲酸25.0 mg,用蒸馏水溶解并定容至100 mL,配得对羟基苯甲酸标准溶液,浓度为0.25 mg/mL。准确移取标准品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL于25 mL比色管中,用水定容至10 mL。各加入1.0 mL稀释两倍的Folin-酚试剂和20%碳酸钠溶液2.0 mL,充分混匀,沸水浴加热1 min,冷水冷却并稀释至25 mL。室温放置30 min,于745 nm波长测定吸光度。以对羟基苯甲酸浓度为横坐标,吸光度作为纵坐标建立标准曲线,y=0.0672+0.0011x(R2=0.9980)。各取一定体积的样品上清液,按上述方法操作进行总酚含量测定。每个样品平行测定3次。

1.2.4 总黄酮含量测定 参考方芳[15]方法并稍作调整。称取经105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品7.5 mg,加入无水乙醇溶解并定容至50 mL,配成标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、2.00、3.00、4.00 mL至10 mL刻度比色管中,加30%乙醇溶液至5 mL,加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL,振摇后放置5 min,加入10%硝酸铝溶液0.3 mL摇匀后放置6 min,加入1.0 mol/L NaOH溶液4 mL,30%乙醇溶液定容至10 mL,静置10 min。以零管为空白,在510 nm处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,芦丁浓度为横坐标,绘制标准曲线,y=0.03986+0.0006x(R2=0.9983)。各取1 mL待测样品上清液(稀释到工作曲线线性范围内),加入10 mL刻度比色管中,同上操作。每个样品平行测定3次。

1.2.5 清除DPPH自由基能力的测定 参照Brand-Williams等[16]建立的方法并稍作调整,准确配制浓度为1×10-4mol/L的DPPH溶液。移取上述籽粒苋籽实提取液0.2 mL,DPPH溶液3.8 mL,混匀,以0.2 mL 50%乙醇与DPPH反应液为空白。避光反应1 h,517 nm测定吸光度。各样品浓度为33.33 mg/mL时,计算DPPH自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100,其中A1为测试液吸光度,A0为空白对照组的吸光度。

1.2.6 清除ABTS+自由基能力的测定 参照Re等[17]建立的方法并稍作调整,将7 mmol/L的ABTS溶液和140 mmol/L的过硫酸钾溶液,以500∶88比例混合,避光静置12～16 h,形成墨绿色稳定化合物,作为储备液。将储备液用乙醇稀释至734 nm吸光度0.70±0.02。移取上述提取液0.1 mL,加入ABTS+储备液3.9 mL,混匀后,避光静置6 min,测试734 nm波长吸光度A1。以0.1 mL 50%乙醇和3.9 mL ABTS+工作液吸光度为空白对照A0。因此,当样品浓度33.33 mg/mL时,测得ABTS+自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

1.2.7 铁离子还原能力测定 参考Benzie等[18]建立的方法并稍作调整,以10∶1∶1混合0.3 mol/L(pH3.6)的醋酸缓冲溶液,10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L氯化铁溶液,即得FRAP工作液。准确吸取0.1 mL系列浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L的硫酸亚铁溶液,与0.3 mL去离子水混合,再加入3.9 mL FRAP溶液,混匀,37 ℃反应4 min。于593 nm测吸光度,绘制硫酸亚铁-吸光度标准曲线。

准确吸取0.1 mL上述样品提取液,与0.3 mL去离子水混合,再加入3.9 mL FRAP溶液,混匀,37 ℃反应4 min,593 nm测吸光度。以硫酸亚铁标准曲线计算出相应的FeSO4浓度,定义为当量浓度(FRAP值)。最终结果表示为每克样品中相当于FeSO4的量(mmol FeSO4/L/g样品)。FRAP值越大,表示抗氧化活性越强。

1.3 数据分析

数据分析采用SPSS 20.0 统计分析软件包,所有实验均重复测定3次,数据以Mean±SD表示,并采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组之间均数的差异性检验,p<0.05认为具有显著性差异,相关性分析采用Pearson相关分析。

2 结果与讨论

2.1 蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实总酚和总黄酮含量的影响

图1a、1b分别表示蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实总酚和总黄酮含量的影响。采用Folin-酚法测定样品的总酚含量,未汽爆组所测总酚含量为(1.459±0.140) mg/g干物质(以对羟基苯甲酸计),略低于文献报道[19]。

从图1a中可以看出,当汽爆压力0.3 MPa时,随着时间延长,总酚含量不断增加,在120 s时达到最高值4.500 mg/g,是未汽爆样品总酚含量的3.1倍。当汽爆压力达到0.6 MPa时,总酚含量显著增加(p<0.05),在60 s时达到7.798 mg/g,此时,总酚含量在所有处理条件下达到最高,是未汽爆样品的5.3倍;当时间延长一倍时(120 s),总酚含量反而出现下降,为7.221 mg/g。继续增大汽爆压力,在0.9和1.2 MPa两种压力条件下,样品总酚含量呈现与低压条件下不同的变化趋势。当汽爆时间低于20 s时,两压力条件下的总酚含量均明显高于未汽爆组和低压力组(0.3 MPa,p<0.05);当时间增加,总酚含量均呈现下降趋势,在1.2 MPa、120 s时达到最低值,为1.559 mg/g,略高于未汽爆组。当汽爆压力持续增大至1.5 MPa,0～60 s时总酚含量仅略高于未汽爆组,120 s甚至低于未汽爆组。因此,在0.6 MPa、60 s的汽爆条件下,籽粒苋籽实总酚含量达到最高值。

图1 蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实总酚和总黄酮含量的影响

采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定样品的总黄酮含量,未汽爆组测得总黄酮含量为(0.629±0.170) mg/g干物质(以芦丁计)。从图1b中可以看出,不同汽爆压力条件下,随着时间延长,总黄酮含量同总酚含量变化趋势类似,在0.6 MPa、120 s时总黄酮含量达到最高值,为4.618 mg/g,是未汽爆样品的7.3倍。

低处理强度下,总酚含量随处理时间延长而增加;而在高处理强度下,总酚含量反而下降。该实验趋势与Gong[8]、刘翀[12]、赵梦丽[13]、张瑞婷[20]等研究基本一致。张瑞婷[20]研究汽爆处理对麦麸总酚的影响,在2.5 MPa、30 s时,总酚含量最高,达到了28 mg/g,约是未处理组的9倍。进一步增加处理条件,总酚含量下降。一般认为,谷物中的大部分酚类物质都是与蛋白质、糖类、纤维素等大分子结合,不易提取[21]。原料在蒸汽爆破过程中,物理结构和化学成分会发生较大变化,存在着类似酸水解、热降解、类机械断裂、氢键断裂和结构重排等协同作用[11]。这些物理和化学作用促使谷物中的木质素、纤维素和半纤维素发生不同程度的降解,此时,与之结合的酚类物质得到大量释放,因此在较低汽爆压力下,总酚含量随着时间延长而不断提高。但是,酚类物质并不能随着汽爆条件的提高而无限增加,在0.9、1.2 MPa压力下,总酚含量呈现明显的先升后降的变化趋势,在1.5 MPa时,总酚含量非常低,始终接近甚至低于未汽爆样品。究其原因,高温可能会造成酚类物质的分解[22],过高强度的汽爆处理会造成酚类物质的损失。

此外,观察汽爆处理后的样品性状,图2是汽爆压力0.6 MPa时,不同汽爆时间的籽粒苋籽实图片。发现随着时间延长,籽实颜色逐渐加深,破碎颗粒数有所增加,伴随糊化现象;图3是汽爆时间60 s时,不同压力的籽粒苋籽实图片,发现在1.2、1.5 MPa下,大部分籽实破碎,糊化严重,出现结块现象,有焦糊气味。由此可知,高强度或长时间汽爆处理可能会伴随不同程度的美拉德反应,极有可能造成酚类物质、黄酮类物质的损失。因此,1.5 MPa处理强度过大,已不适合籽粒苋籽实样品,可以弃去。

图2 不同汽爆时间的籽粒苋籽实的拍照图片

图3 不同汽爆压力的籽粒苋籽实的拍照图片

2.2 蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实抗氧化能力的影响

2.2.1 蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实清除DPPH自由基能力的影响 DPPH自带单电子,非常稳定,其乙醇溶液在517 nm有强吸收,呈紫色。当存在自由基清除剂时,可与DPPH单电子配对而导致吸收减弱,颜色减弱程度与自由基清除能力呈正相关,可用于衡量研究对象的抗氧化能力。

如图4所示,与未汽爆样品DPPH自由基清除率(16.81%±1.15%)相比,经过0.3、0.6 MPa蒸汽爆破处理后,籽粒苋籽实清除DPPH自由基的能力显著提高(p<0.05)。0.3 MPa、120 s条件下,DPPH自由基清除率达到该压力条件下的最大值,为33.62%±1.94%,是未汽爆样品的2.0倍。继续升高汽爆压力,增至0.6 MPa,随着汽爆时间延长,DPPH自由基清除率在60 s、120 s时分别达到76.62%±2.98%和75.65%±0.77%,依次是未汽爆样品的4.6倍和4.5倍。可知汽爆压力0.6 MPa、汽爆时间60 s时,样品对DPPH自由基清除率最高。继续增大汽爆强度,从图4中可知,0.9、1.2 MPa条件下,DPPH自由基清除率先提高再陡然降低;而在1.5 MPa时,DPPH自由基清除率在不同的时间段均低于未汽爆组,即最高强度的汽爆处理反而造成DPPH自由基清除效果大大降低。张瑞婷[20]研究发现汽爆条件1.5 MPa、90 s时,麦麸提取液有最高的清除DPPH自由基水平,继续增加压力和时间,反而呈略微下降趋势,与本研究结果类似。可推测,蒸汽爆破处理对于籽粒苋籽实抗氧化成分如酚类物质的释放是有限的,当达到一定强度后,样品清除DPPH自由基效果不再明显;而更高强度蒸汽爆破处理有可能造成抗氧化成分的损失[22],样品清除DPPH自由基能力降低。

图4 蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实清除DPPH自由基能力的影响

2.2.2 蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实清除ABTS+自由基能力的影响 ABTS在氧化剂存在下能生成稳定的蓝绿色化合物ABTS+,ABTS+在734 nm波长有最大吸收,当存在抗氧化成分时,能够减少ABTS+的生成,从而使蓝绿色褪去,通过测定颜色褪去的程度即可衡量样品的抗氧化能力。

如图5所示,汽爆处理后ABTS+自由基清除率的变化趋势同DPPH测定结果呈现一致性。测定结果表明,在低汽爆压力下(0.3、0.6 MPa),蒸汽爆破处理后籽粒苋籽实的抗氧化能力有所提高,在0.6 MPa、60 s时有最强抗氧化效果(p<0.05)。其中,未汽爆样品的ABTS+自由基清除率为22.93%±1.85%,0.6 MPa、60 s时ABTS+自由基清除率为86.17%±1.08%,后者是前者的3.8倍。Gong[8]测定汽爆处理前后青稞麸皮的ABTS+清除能力,最大增至9.1倍。

图5 汽爆处理对籽粒苋籽实清除ABTS+自由基能力的影响

2.2.3 蒸汽爆破预处理对籽粒苋籽实铁离子还原能力的影响 样品具有还原能力,可间接认为其具有一定的抗氧化能力[23]。在较低pH条件下,赤血盐K3Fe(CN)6中的三价铁Fe3+可被还原性成分还原为二价铁黄血盐Fe4(Fe(CN)6,Fe2+与三吡啶三吖嗪TPTZ形成蓝色复合物,在593 nm处有最大吸收,通过测定吸光度的大小计算样品的还原能力。

如图6所示,汽爆处理后亚铁离子还原能力的变化趋势同DPPH、ABTS+测定结果一致。结果表明,在低汽爆压力下(0.3 MPa),蒸汽爆破处理后籽粒苋籽实的亚铁离子还原能力随时间延长而缓慢升高,0.6 MPa汽爆压力下,亚铁离子还原能力增幅急剧,在0.6 MPa、60 s时达到最强还原能力(p<0.05)。其中,未汽爆样品的亚铁离子还原能力为(57.50±14.3) mmol FeSO4/L/g,0.6 MPA、60 s时为(667.10±17.84) mmol FeSO4/L/g,后者是前者的11.6倍,该汽爆条件下样品的亚铁离子还原能力非常强。Gong[8]测定汽爆处理前后青稞麸皮的亚铁离子还原能力,220 ℃、120 s获得最好效果,亚铁离子还原能力最大增至2.8倍。刘翀[12]发现在2.5 MPa、30 s的蒸汽爆破条件下,麦麸提取液有最强的亚铁离子还原能力。张瑞婷[20]通过测定不同汽爆条件下的麦麸样品铁离子还原能力的变化,发现在2.5 MPa、90 s时达到最大值,继续加大处理强度,反而有所下降,与本实验结果类似,这表明过高强度的蒸汽爆破处理不利于籽粒苋籽实抗氧化成分的释放。

图6 汽爆处理对籽粒苋籽实亚铁离子还原能力的影响

2.3 籽粒苋籽实抗氧化能力和总酚、总黄酮含量的相关性分析

由图1、图4、图5、图6可观察到蒸汽爆破处理后样品的总酚、总黄酮含量与抗氧化能力(DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、铁离子还原能力)有相似的变化趋势。因此,本文进一步分析了不同汽爆条件下籽粒苋籽实总酚、总黄酮含量与抗氧化能力各指标之间的相关性,结果如表1所示。DPPH自由基清除率与总酚、总黄酮含量均具有显著的正相关性,相关系数分别为r=0.9343,p<0.05;r=0.9773,p<0.05。此外,不同汽爆条件下籽粒苋籽实清除ABTS+自由基的能力与总酚、总黄酮含量两两之间也呈现显著的正相关性,r=0.9376,p<0.05;r=0.9786,p<0.05。进一步分析了不同汽爆条件下籽粒苋籽实总酚、总黄酮含量与铁离子还原能力的关系,均表明具有显著的正相关性(r=0.9384,p<0.05;r=0.9111,p<0.05)。从以上相关性分析可知,籽粒苋籽实的抗氧化能力与其总酚、总黄酮含量密切相关,抗氧化能力的大小取决于总酚、总黄酮含量的高低,与Gong[8]、孙丹[21]、袁佐云[24]等结论一致。

表1 不同汽爆条件的籽粒苋籽实抗氧化能力与总酚、总黄酮含量的相关性分析

3 结论

在一定处理条件下,蒸汽爆破处理有助于籽粒苋籽实酚类、黄酮类物质的提取,抗氧化能力增强。低处理强度(0.3、0.6 MPa)利于纤维素、半纤维素和木质素的降解,结合态的酚类物质大量释放,在0.6 MPa、60 s时达到最佳条件,此时总酚、总黄酮含量分别为未汽爆组的5.3倍和7.3倍,差异显著(p<0.05)。较高强度的处理条件(0.9、1.2 MPa)不利于酚类、黄酮类物质的提取,更高强度时(1.5 MPa)甚至低于未汽爆组,在于过高强度的蒸汽爆破处理可能会造成酚类物质的分解。

籽粒苋籽实经蒸汽爆破处理后抗氧化能力明显增强,在0.6 MPa、60 s时,清除DPPH、ABTS+自由基能力、铁离子还原能力分别是未汽爆组的4.6、3.8和11.6倍。抗氧化能力的增强与总酚、总黄酮含量的增加密切相关,分析显示,各抗氧化指标与总酚、总黄酮含量均有显著的正相关性。

蒸汽爆破过程无化学试剂添加,对环境友好,且处理后能大大提高籽粒苋籽实活性成分的含量和抗氧化能力,效果明显,可为籽粒苋籽实的后续开发奠定基础。