利用秋水仙碱诱导美洲黑杨2n花粉的初步研究

赵鑫闻

(辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115200)

1 引言

黑杨派是杨柳科(Salicaceae)杨属(PopulusL.)五大派之一，栽培利用价值极高，具有速生丰产、实用性强、无性繁殖能力强等特点，是世界杨树人工林的重要树种资源。[1～2]而在辽宁、吉林、内蒙古等省区，美洲黑杨常遭遇冻害，出现干稍和整株死亡现象，遇到干旱少雨年份，生长量也大幅降低，美洲黑杨的抗逆性亟待改良。实践证明，三倍体育种在遗传增益、材质改良、速生、抗逆性等方面有非常大的优势，是杨树遗传改良的1条有效途径。

杨树多倍体育种的主要方法有从自然界中直接选择天然多倍体，体细胞染色体加倍，不同倍性体间杂交，天然或人工诱导未减数配子杂交等，现已利用各种方法取得了一定成就。Johnsson最早采用秋水仙碱处理欧洲山杨、美洲山杨雄花枝，取得了一些2n 花粉，然后给雌花枝授粉,均得到了三倍体植株[4]。张志毅(1992)等利用高温和秋水仙碱处理毛新杨均获得了2n花粉，并取得了三倍体植株；康向阳等(1996)则在掌握杨树花粉母细胞减数分裂规律的基础上，明确了决定花粉染色体加倍效果的减数分裂有效处理时期及高效获得白杨杂种三倍体的育种技术体系[6～9]。李云等(2001)利用秋水仙碱处理白杨雌花芽，获得13株白杨三倍体[10]；李开隆等(2006)利用秋水仙碱诱导大青杨2n花粉，得到了10%直径为37.5

2 材料与方法

2.1 材料

美洲黑杨33号杨(P.deltoidescl.‘33’)雄花枝于2016年3月采集于辽宁省凌海市辽宁省杨树研究所基因库，用塑料膜包裹，保持潮湿，运回后保存于低温的苗木窖中。

2.2 方法

2.2.1 2n花粉的诱导

将采集的美洲黑杨雄花枝移入温室进行水培，分别在水培3 d、4 d、5 d时(水培2 d时花序尚未伸出鳞片，水培6 d时花序开始产生花粉)，利用0.3%、0.5%、0.8%的秋水仙碱溶液处理美洲黑杨雄花芽，即用微量注射器将秋水仙碱溶液注入雄花芽中，每天注射3次，每次30 ul～40 ul，两次处理时间间隔为5 h～7 h。每种处理10～15个雄花芽，每5个雄花芽得到的混合花粉为1次重复(表1)。

表1不同水培时间利用不同浓度秋水仙碱进行美洲黑杨2n花粉的诱导

浓度水培时间(d)C10.3%3C20.3%4C30.3%5C40.5%3C50.5%4C60.5%5C70.8%3C80.8%4C90.8%5

2.2.2 2n花粉的统计与纯化

2n花粉的统计与纯化，分别按照不同处理收集获得的花粉，并混合均匀，每个处理取少量花粉做5个临时涂片，每个涂片观察5个视野，测量视野内花粉的直径，A1 表示花粉粒直径d<25 μm 范围；A2 表示25 μm50 μm。分别统计每个处理中获得的各级花粉数量及所占比例并分析[11]。研究表明直径大于37 μm 的花粉为染色体未减数的2n 花粉[5，7，17]，因此本试验中A3和A4级花粉为2n花粉。

3 结果与分析

3.1 不同水培时间及不同浓度秋水仙碱的诱导效果

将采集的美洲黑杨雄花枝移入温室进行水培，水培3 d后花序开始伸长，即开始进行美洲黑杨2n花粉的诱导，分别在水培3 d、4 d、5 d时利用0.3%、0.5%、0.8%的秋水仙碱处理美洲黑杨雄花芽，结果显示，水培3 d，4 d，5 d后利用0.3%，0.5%，0.8%的秋水仙碱进行处理，均得到了一定比例的2n花粉，其中水培3 d后利用0.5%的秋水仙碱进行处理获得的2n花粉数量最多，获得直径37.5 μm

表2诱导美洲黑杨各级花粉数及百分率

注：A1 表示花粉粒直径d<25 μm 范围；A2 表示25 μm50 μm。

图1 经秋水仙碱处理的不同级别的美洲黑杨花粉

3.2 美洲黑杨2n花粉诱导方差分析

从表3方差分析结果来看，处理时间及秋水仙碱浓度对美洲黑杨2n花粉的诱导影响均较大，达到极显著水平，因此在利用秋水仙碱进行美洲黑杨大花粉的诱导的过程中，不仅要注意处理时间的把握，同时也要选择合适的秋水仙碱浓度，本试验结果表明，水培3 d时利用0.5%的秋水仙碱溶液对美洲黑杨雄花芽进行处理得到的2n花粉最多。

表3不同处理所得2n花粉方差分析

4 结论与讨论

本试验研究结果表明，水培3d时利用0.5%的秋水仙碱溶液对美洲黑杨雄花芽进行处理得到的2n花粉最多，获得A3级(37.5 μm

据朱之悌院士观测，毛白杨雄株花粉中，除那些扁小、空瘪、无核等败育花粉外，均可观察到有大花粉粒的广泛存在，并混杂在众多的小花粉粒中，但大花粉粒直径要超过小花粉粒1 倍以上，很容易识别；大花粉粒直径变动在35 μm～45 μm 之间，疑为未减数的二倍体花粉[16]。据Einspahr 和Mashkina 经验，直径大于37 μm 的花粉为染色体未减数的2n 花粉[17]。张志毅等研究表明2n 花粉粒直径远远大于正常的单倍体花粉粒，约在 37 μm 以上[5]。康向阳经发芽镜检，其染色体数为38，一般的正常毛白杨单倍体花粉染色体数为19[7]。通过光学显微镜测定，经过加倍处理的美洲黑杨花粉直径通常在15 μm～45 μm 之间，因此我们要根据其花粉直径的大小进行分级研究，我们将直径大于37 μm的花粉作为大花粉的标志加以统计，得到的A3和A4 级花粉极有可能是2n 花粉。下一步我们将对其进行鉴定研究。得到的2n花粉也有可能是天然大花粉，但其数量较少，而且每个处理中都有可能产生天然大花粉，不影响试验结果，因此在本试验中没有设计对照。

人工诱导花粉染色体加倍途径获取杨树多倍体是最简洁、可靠的途径之一[7]。利用秋水仙碱或高温等诱导方法获得的2n雌雄配子在欧洲山杨、美洲山杨、香脂杨、毛新杨、银腺杨、青杨、大青杨等杨树中，均已获得三倍体植株[4-17]。杨树多倍体植株通常在一些性状上优于二倍体[18]。具体表现在巨大性、抗性和一些生理结构的变化，例如生长量增加、抗寒、抗旱、抗病虫害、器官大小、成分含量等[19]。欧洲山杨( Populus tremula) 三倍体比二倍体生长快30 %[20]，材积为二倍体的1.35倍[21]。我国选育的毛白杨( P.tomentosa) 异源三倍体最优无性系(B301)单株材积是自然二倍体的3.5倍(8a生时)[18]。三倍体欧洲山杨抗干旱和瘠薄性能较其亲本二倍体有明显的优势，并且还有较强的抗病虫害的能力[22]。实践证明倍性育种是对杨树进行遗传改良的有效途径。