促红细胞生成素对哮喘小鼠肺组织细胞凋亡的影响

金 灿 闫 娜 池永学 金 政 苏立明

(延边大学附属医院儿科，吉林 延吉 133000)

2014年全球哮喘防治创议〔1〕中对哮喘更新定义，哮喘是一种异质性疾病，以慢性气道炎症为特点的呼吸系统常见病。当前普遍认为哮喘是由多种炎性介质和细胞因子等参与的在细胞、分子、基因水平上发生的疾病。肺组织病理学改变有嗜酸粒细胞(EOS)浸润、支气管管壁痉挛、肿胀、黏液栓形成及气道重塑等〔2〕。目前虽然出现了许多新型抗哮喘药物，吸入型糖皮质激素仍是控制哮喘发作和降低反复发生风险的首选药物。激素类药物作用机制研究较多的如地塞米松，它可抑制Th0细胞向Th2细胞分化，使 Th1/Th2比例趋于平衡〔3〕，也有实验发现它可通过对抑制Bcl-2的表达而调节EOS凋亡。促红细胞生成素(EPO)是能够促进红细胞生成的一种激素样物质，具有抗炎、免疫调节、抗凋亡等作用，还能对心、脑等组织起到保护作用〔4，5〕。但EPO对肺脏作用的研究比较少见，尤其是对哮喘的研究。本实验旨在观察EPO对迟发型哮喘模型中两种细胞因子、肺组织、细胞凋亡的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 延边大学医学院动物中心提供的SPF级昆明小鼠(雌性)40只，6～8周龄，体重(20±2)g。

1.2试剂 鸡卵清蛋白(OVA，美国Sigma公司)，液态氢氧化铝 (德国Thermo公司)，重组人EPO(沈阳三生制药有限责任公司)，地塞米松磷酸钠注射液(山西晋新双鹤药业有限责任公司)，白细胞介素(IL)-4及IL-5试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)，转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)细胞凋亡原位检测试剂盒(南京碧波生物科技有限公司)，Bax、Bcl-2和Caspase-3抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.3仪器 空气压缩式雾化器PARI (德国百瑞有限公司)，显微镜系统 BX51 (日本奥林巴斯公司)，酶标仪PT-3502G (北京普天新桥技术有限公司)。

1.4制备哮喘小鼠模型 小鼠40只随机分为正常对照(A)组、哮喘模型(B)组、EPO低浓度(C)组、EPO高浓度(D)组和地塞米松(E)组，8只/组。B组利用OVA 20 μg+氢氧化铝2 mg分别于第1、8、15天行腹腔注射，在第22天将小鼠置于封闭玻璃缸中通过空气压缩泵雾化吸入3%OVA，30 min/次，1次/d，连续7 d。A组用生理盐水取代OVA进行攻击，频率、时间同上。C、D、E组于第22天起每次雾化吸入前30 min给药连续治疗1 w(C组EPO 500 IU/kg、D组EPO 1 000 IU/kg、E组地塞米松1 mg/kg，均腹腔注射)。攻击结束1 w后对B、C、D、E组再次给予3%OVA(A组用生理盐水)做最后1次激发。

1.5血清IL-4和IL-5测定 各组分别于末次攻击24 h后，乙醚麻醉处死，摘眼球取血2～3 ml，离心1 200 r/min，取上清，应用酶联免疫吸附实验测定血清中IL-4和IL-5水平。具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.6取肺组织 沿气管切开，取右肺，用4%多聚甲醛固定24 h以上，脱水，透明，渗透，包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色和TUNEL染色备用。

1.7HE染色 将肺组织切片，预热，融化，脱蜡，染色，透明，固定，形成切片。

1.8TUNEL细胞凋亡原位检测 石蜡切片脱蜡、水合，乙醇水合，处理好后浸入磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入蛋白酶K工作液，室温混合作用30 min。浸置PBS中漂洗，浸入封闭液，室温下10 min，PBS漂洗，滤纸吸干，加TdT酶反应液，于37℃中避光湿润60 min，荧光胶封片，镜下观察，激发波长450～500 nm，发射波长515～565 nm。计算5个高倍镜下(×200)凋亡细胞数，每百个细胞中的凋亡细胞数表示凋亡指数，每组取平均值。

1.9Western印迹法检测凋亡蛋白 蛋白的提取：将肺组织置于液氮5 s，敲碎组织，称重5倍体积细胞裂解液+10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，组织匀浆，沸水水浴5 min，冰上2 min，4℃13 000 r/min离心10 min，取上清。工作液配制、制标准曲线、Excel计算。制胶、灌胶、上样。电泳，转膜，封闭，加Bax、Bcl-2和caspase-3一抗，加二抗，显影、拍照，应用Quantity One 蛋白灰度分析软件完成。

1.10统计学方法 采用SPSS16.0软件行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1哮喘模型的鉴定 A组体重自然增加，其余4组腹腔注射及雾化吸入后逐渐出现呼吸急促、烦躁、挠鼻子、大小便失禁等症状，伴精神差、活动少、进食及饮水减少等；症状表现的严重程度上看，B组表现最重，持续时间最长，C、D、E组症状明显减轻。

2.2血清中IL-4和IL-5的水平比较 与A组比，B和C组IL-4和IL-5水平均明显提高(P<0.05)，D和E组无显著差异(P>0.05)；与B组比，D和E组IL-4和IL-5水平明显降低 (P<0.05)，C组无显著差异(P>0.05)；与E组比，C组IL-4和IL-5水平明显提高(P<0.05)，见表1。

表1 各组IL-4和IL-5水平比较

与A组比：1)P<0.05；与B组比：2)P<0.05；与E组比：3)P<0.05，下表同

2.3HE染色镜下肺组织的病理形态观察 A组气管管腔光滑，黏膜上皮完整、无水肿，肺泡间隔正常，偶见EOS浸润；B组气管黏膜损伤严重，充血、水肿、基底层增厚，肺泡壁及肺泡腔内可见大量炎性细胞浸润，E、D组明显增多；C组气管黏膜可见充血、水肿，基底层仍厚，但气管周围炎症细胞浸润较B组略有减轻；D组气管黏膜充血、水肿不明显，基底层略增厚，炎症细胞明显减少；E组气管黏膜接近正常，基底层略增厚，少量炎症细胞浸润。见图1。

2.4TUNEL法原位细胞凋亡检测 与A组〔(3.98±1.36)%〕比，B、C、D和E组凋亡指数〔(7.03±1.02)%、(11.68±2.98)%、(17.24±3.05)%、(20.31±3.73)%〕均明显提高(P<0.05)。与B组比，C、D和E组凋亡指数均明显升高(P<0.05)，见图2。

图1 各组肺组织HE染色结果(×200)

2.5各组Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表达 与A组比，B、C、D和E组Bax均明显升高(t=46.94、29.14、26.43、23.50，均P<0.05)；与B组比，C、D、E组Bax明显降低(t=29.07、51.70、72.77，均P<0.05)。与A组比，B、C、D、E组Bcl-2明显降低(t=77.79、8.94、16.32、14.35，P<0.05)；与B组比，C、D、E组Bcl-2明显升高(t=27.34、26.14、4.87，均P<0.05)；与A组比，B、C、D和E组Caspase-3明显升高(t=35.70、50.50、38.52、13.50，均P<0.05)；与B组比，C、D、E组Caspase-3明显降低(t=10.25、17.81、22.61，均P<0.05)。与A组比，B、C、D、E组Bax/Bcl-2明显升高(t=279.43、135.48、171.52、141.23，均P<0.05)；与B组比，C、D、E组Bax/Bcl-2明显降低 (t=52.32、78.94、41.52，均P<0.05)，见图3和表2。

组别Bax/β-actinBcl-2/β-actinCaspase-3/β-actinBax/Bcl-2A组0.113±0.0110.876±0.0130.109±0.0750.129±0.012B组0.914±0.0471)0.309±0.0061)1.103±0.0241)2.958±0.0261)C组0.375±0.0231)2)3)0.451±0.0421)2)3)0.403±0.0311)2)3)0.831±0.0361)2)3)D组0.453±0.0151)2)3)0.531±0.0351)2)3)0.611±0.0271)2)3)0.853±0.0231)2)3)E组0.513±0.0111)2)0.733±0.0821)2)0.834±0.0511)2)0.700±0.0371)2)

3 讨 论

目前哮喘的诊疗指南中，糖皮质激素仍是控制哮喘急性发作和降低反复发生风险的关键药物。它可抑制炎症细胞的迁移和活化、细胞因子的生成、炎症介质的释放、增强平滑肌细胞β2受体的反应性等，但需要长期规律使用，机体会逐渐产生糖皮质激素的剂量依赖，诱发糖尿病等严重的不良反应。支气管哮喘迟发相反应(LAR)病理基础使肺组织中EOS明显升高、凋亡延迟〔6〕，促凋亡和抗凋亡机制的不平衡是EOS凋亡延迟的根源。抗EOS凋亡延迟已经成为哮喘治疗的新思路。EPO是一种糖蛋白激素，主要调节和维持循环中红细胞生理水平。EPO主要由肝脏和肾脏合成分泌，婴幼儿时期主要由肝脏合成，成年后主要由肾脏合成。它是能有效地为组织供氧的细胞因子。早期主要用于促红细胞生成而治疗贫血。近年来，研究发现，EPO还具有神经保护、抗凋亡、促进血管生成和控制炎症反应等作用，故被认为是一种具有多器官保护功能的因子〔7〕。目前研究凋亡基因的控制与调节大致分为3类，第1类是凋亡抑制基因如Bcl-2家族，第2类是凋亡促进基因如Bax，第3类是凋亡效应基因Caspase等。有动物实验证实，EPO可能调节Bax/Bcl-2比值对小胶质细胞起到抗凋亡的作用〔8〕。重组人(rHu)EPO具备了EPO相似的生物学活性，现已广泛用于临床中。rHuEPO在新生儿尤其是早产儿及其他原因所致的贫血中，可用于升高红细胞数量，促进细胞免疫功能，治疗贫血，直接减少了输血比例，改善疾病预后。动物实验〔9〕对EPO和地塞米松在慢性哮喘模型中的作用进行比较，EPO可以减轻哮喘的炎症反应。

哮喘发生的主要免疫机制目前已得到公认：即Th1/Th2亚群细胞数量上的失衡和细胞功能的紊乱，尤其哮喘中以Th2细胞数目增多和功能亢进较为多见。哮喘的发生与过敏原特异性Th2优势应答相关〔10〕，Th2能分泌的细胞因子有IL-4，IL-5，IL-10和巨噬细胞集落刺激因子等，发挥着体液免疫的功能。许多研究发现哮喘患者血液中的IL-4显著升高，IL-4可促进EOS、肥大细胞等细胞的增殖及分化，EOS显著增多。IL-4是非IL-5依赖机制的重要炎症因子〔11〕，IL-5是由Th2分泌的细胞因子，与其受体结合，对EOS的聚集、活化、趋化、增殖等起关键作用。IL-5还为EOS释放的骨髓细胞提供信号，促进骨髓细胞的终末分化，抑制EOS凋亡，提高EOS生存能力〔12〕。支气管黏膜内EOS的聚集增多是哮喘的一个重要标志，激活后的EOS发生聚集、活化，并释放一系列的炎症因子，引起组织的水肿、损伤和气道高反应性等。IL-5是气道炎症的关键性调节因子，且与哮喘的严重度相关。IL-4与IL-5构成了EOS增多的主要两大机制。

细胞凋亡可促进炎症的消退和组织更新等。EOS是哮喘气道炎症中主要的效应细胞〔13〕。本研究可见EPO可促进迟发型哮喘模型肺组织细胞凋亡，HE染色结果也佐证了上述结果。

Bax和Bcl-2是目前研究细胞凋亡较多的基因，这两对基因是哺乳类动物细胞凋亡的一对主要调控基因，Bcl-2基因包含多个同源物，其蛋白主要通过凋亡途径的阻断，抑制细胞凋亡的信息传输系统，延长细胞的存活；而Bax则是促凋亡基因中的一种，产生可拮抗Bcl-2的影响，两个基因比值的增减更有利于评价细胞凋亡的趋势。本实验显示EPO和地塞米松可下调Bax/Bcl-2的比值促进细胞凋亡。目前已知的2条凋亡途径：外源性途径：肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员参与通过Caspase-8活化，内源性途径即细胞色素C参与Caspase-9活化，最终引起Caspase级联反应。Caspase-3和Caspase-7是最终激活下游的效应因子，引起细胞发生凋亡。Caspase家族在细胞凋亡中扮演重要角色。本实验中迟发型哮喘时肺组织Caspase-3表达增多，EPO和地塞米松可降低Caspase-3表达。Bax、Bcl-2、Caspase-3三种蛋白在迟发型哮喘模型的肺组织中呈阳性表达；EPO可能通过下调Bax/Bcl-2的比例，降低Caspase-3的表达促进肺组织细胞凋亡。

综上，应用EPO后哮喘小鼠肺组织病理炎性浸润明显减轻，其机制可能是：EPO抑制IL-4、IL-5的表达、下调Bax/Bcl-2的比例，降低Caspase-3的表达促进EOS凋亡。