美满霉素对阿尔茨海默病大鼠前额叶皮层CRMP-2和Caspase-3表达的影响

孙缦利 邓海峰 马 玲 王兴红 常全忠

(漯河医学高等专科学校,河南 漯河 462000)

阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主要表现的中枢神经系统变性疾病。研究发现细胞凋亡在AD的发生、发展过程中起决定性作用〔1〕。脑衰反应调节蛋白(CRMP)-2是调节突触发育的重要分子，能够促进神经元轴突和树突的生长〔2〕。研究报道，增加CRMP-2的磷酸化水平可以导致神经细胞凋亡〔3〕。半胱天冬酶家族(Caspase)能够启动和维持细胞凋亡，而其成员Caspase-3是该细胞凋亡通路下游最重要的凋亡蛋白酶，其表达量直接反映细胞凋亡程度〔4〕。美满霉素是一种半合成的第二代四环素衍生物，安全性高，容易透过血脑屏障到达中枢神经系统〔5〕。大量研究表明美满霉素可以通过抑制小胶质细胞激活、炎症反应、氧化应激等途径保护神经细胞进而发挥脑保护功能，是一种有效的神经保护剂〔6，7〕。本文前期实验也表明美满霉素可以通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡改善AD认知障碍〔8〕。美满霉素对细胞凋亡的抑制是否和CRMP-2通路有关，目前国内外很少报道。本实验拟探讨美满霉素对AD大鼠的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 Morris水迷宫装置(中国医学科学院药物研究所研制)；DW-5大鼠脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司)；美满霉素胶囊(100 mg/粒，中国惠氏制药有限公司)；青霉素(哈药集团)；兔多克隆抗体CRMP-2、兔多克隆抗体p-CRMP-2(Thr514)、兔多克隆抗体Caspase-3均购自Abcam公司；山羊抗兔二抗购自碧云天生物技术公司；Aβ25～35、戊巴比妥钠购自Sigma公司。

1.2动物分组及给药 48只健康雄性SD大鼠(体质量240～260 g)由河南省实验动物中心提供，均在自然光暗周期的环境中饲养，自由觅食、饮水。随机分成对照组、模型组和美满霉素组。对照组：常规饲养2 w后，侧脑室注射生理盐水2 μl，术后腹腔内注射生理盐水10 ml·kg-1·d-1；模型组：常规饲养2 w后，侧脑室注射Aβ25～352 μl，术后腹腔注射同对照组；美满霉素组：常规饲养1 w后，腹腔注射美满霉素50 mg·kg-1·d-1，剂量10 ml/kg，第2周末侧脑室注射Aβ25～352 μl，术后继续腹腔注射美满霉素50 mg·kg-1·d-1。

1.3AD模型的制备 凝聚态Aβ25～35制备：用二甲基亚砜50 μl溶解0.1 mg Aβ25～35，再用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)50 μl稀释成10 μg/μl的溶液，置于37℃温箱孵育72 h，观察其呈现明显絮状，孵育完成，4℃冰箱保存备用。

大鼠用0.8%戊巴比妥钠(0.1 ml/10 g，腹腔注射)麻醉后，固定于脑立体定位仪上。参照大脑脑立体定位图谱，以前囟为原点，向后1.5 mm，旁开0.8 mm为穿刺点，颅钻穿孔，自颅骨表面进针3.5 mm至侧脑室，用微量注射泵将2 μl凝聚态Aβ25～35在5 min内缓慢注入，留针5 min，使 Aβ25～35充分浸润局部组织，退针后缝合伤口。对照组给予2 μl生理盐水，其余两组均为2 μl Aβ25～35。术后给予青霉素肌肉注射，伤口处碘伏消毒，1次/d，共5 d。

1.4水迷宫实验 Morris水迷宫水池中加入适量的墨汁，使水池成为不透明色(去除视觉干扰)，平台置于水面以下2 cm，水温保持22～23℃。水迷宫实验历时6 d，1～5 d为定位航行实验，将大鼠面向池壁放入水池，记录大鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为逃避潜伏期，大鼠找到平台后，让其在平台上站立60 s。若入水后120 s大鼠未能找到平台，则用木杆将其引导至平台，并停留10 s，随后用纸巾将大鼠擦干净放回笼中，进行下一只大鼠实验。第6天撤去平台，进行空间探索实验，将大鼠从同一个入水点放入水中，测其第1次到达原平台位置的时间、120 s内穿环次数。用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。

1.5免疫组织化学法检测大鼠前额叶皮层CRMP-2和Caspase-3表达 每组各取一半大鼠用0.8%戊巴比妥钠麻醉，经4%多聚甲醛心脏灌流，用徕卡冰冻切片机对灌流固定好的组织进行冠状面切片，厚度为30 μm。所得切片置于0.01 mol/L PBS (pH7.4)洗3次，每次5 min。用0.3% Triton X-100破膜处理2 h，2 h后用0.01 mol/L PBS 洗3次，然后用10%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h。处理好的脑片分别用以下抗体(浓度)，兔多克隆抗体CRMP-2(1∶500)、兔多克隆抗体Caspase-3(1∶500)4℃ 孵育48 h。然后用0.01 mol/L PBS洗3次，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h，0.01 mol/L PBS 洗3次，90%甘油封片，镜检、拍照，应用Image Proplus6.0图像分析软件测平均积分光密度(IOD)。

1.6Western印迹法检测大鼠前额叶皮层CRMP-2和p-CRMP-2表达 每组各取一半大鼠用0.8%戊巴比妥钠麻醉，经4%多聚甲醛心脏灌流，快速取出全脑，冰浴分离出大鼠前额叶皮层，按10 ml/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，转NC膜。杂交步骤如下：10%脱脂牛奶封闭NC膜1 h，TTBS(20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；0.15 mmol/L NaCl；0.05% Tween 20)漂洗3次，每次10 min，然后室温下与兔多克隆抗体CRMP-2(1∶1 000)、兔多克隆抗体p-CRMP-2(Thr514)(1∶1 000)杂交反应2 h，TTBS漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶3 000)杂交反应1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入电化学发光(ECL)试剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室进行X线胶片曝光、显影和定影。

1.7统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1Morris水迷宫实验结果 与对照组相比，模型组逃避潜伏期和第1次到达原平台位置的时间明显延长，穿环次数明显减少(P<0.01)；与模型组相比，美满霉素组逃避潜伏期和第1次到达原平台位置的时间明显缩短，穿环次数明显增加(P<0.01)。见表1。

表1 各组水迷宫、跳台实验结果比较

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；同表2

2.2免疫组织化学法检测各组前额叶皮层CRMP-2和Caspase-3蛋白表达 与对照组比较，模型组CRMP-2蛋白表达显著降低，Caspase-3表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，美满霉素组CRMP-2蛋白表达显著升高，Caspase-3表达显著降低(P<0.01)。被标记上棕色或棕黄色的为阳性细胞。见图1，表2。

图1 各组大鼠前额叶皮层CRMP-2与Caspase-3的表达(×200)

组别CRMP-2(IOD)Caspase-3(IOD)CRMP-2p-CRMP-2对照组0.81±0.070.46±0.041.14±0.280.31±0.02模型组0.42±0.031)0.93±0.081)0.57±0.041)0.84±0.111)美满霉素组0.65±0.052)0.78±0.062)0.73±0.092)0.56±0.052)

2.3Western印迹检测各组前额叶皮层CRMP-2和p-CRMP-2表达 与对照组相比，模型组CRMP-2表达显著降低，p-CRMP-2表达显著上升(P<0.01)；与模型组相比，美满霉素组前额叶皮层CRMP-2表达均显著升高(P<0.01)，p-CRMP-2表达显著下降(P<0.01)。见图2，表2。

图2 各组前额叶皮层CRMP-2和p-CRMP-2的表达

3 讨 论

AD是由多种原因导致的脑组织损伤，进而引起严重的认知功能障碍为特征的中枢神经系统退行性疾病。据调查，2010年我国AD人数已跃居世界第一位，且随着人口老龄化的加剧，AD 人数呈逐年增加的趋势，给社会和患者家庭带来严重的经济和精神负担〔9〕。

前额叶皮层是大脑高级认知活动的关键区域，在注意力、情绪调节、学习记忆过程中起重要作用〔10〕。研究发现细胞凋亡在AD的发生、发展过程中起重要作用〔11〕。Caspase-3是位于哺乳动物细胞凋亡通路下游关键的死亡蛋白酶。正常情况下，胞质中的Caspase-3以无活性的酶原形存在，细胞凋亡信号的出现可导致 Caspase-3裂解、活化，活化的Caspase-3又进一步导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向死亡〔2，12〕。因此Caspase-3表达量可以直接反映细胞凋亡程度。

CRMP-2是CRMP家族中的一员，在神经组织内广泛表达，参与神经元突起的生长、钙离子内态稳定性等多种神经生理活动，对神经的生长发育具有重要作用〔3〕。研究报道，CRMP-2可抑制凋亡前体基因p53的表达，调节Sema3A诱导的细胞凋亡〔13〕。幸享凤等〔14〕证实CRMP-2可通过上调Bcl-2、下调Caspase-3及p53的表达改善神经细胞凋亡，减轻缺血再灌注造成的大鼠神经功能缺损。增加CRMP-2的磷酸化水平可以导致神经细胞凋亡〔4〕。

本文结果表明美满霉素对细胞凋亡的抑制和CRMP-2通路有关，可以通过上调CRMP-2表达、降低CRMP-2磷酸化水平，进而下调Caspase-3的表达，抑制神经细胞凋亡，改善AD大鼠的学习记忆能力。