CrisprCas9系统敲除SDC1表达对骨髓瘤U266细胞增殖的影响

刘琳琳　庄银苹　王永

【摘要】目的 利用CrisprCas9慢病毒干扰系统敲除Syndecan 1 （SDC1）表达，检测其对骨髓瘤细胞增殖的影响。方法 Q-PCR方法初步检測SDC1基因在多种骨髓瘤细胞系中的表达情况。选取U266细胞系，利用CrisprCas9系统稳定敲除SDC1的表达，通过流式细胞术，western blot，Q-PCR等技术检测SDC1敲除效率。进一步利用CCK8法检测敲除SDC1后对骨髓瘤细胞增殖的影响。结果 SDC1基因在U266和IM9细胞中高水平表达。流式细胞术检测发现敲除SDC1后，CD138阳性细胞数显著降低。western blot和Q-PCR方法检测发现CrisprCas9系统显著降低了SDC1在U266细胞中的蛋白及mRNA表达水平。CCK8实验证实敲除SDC1后显著抑制U266细胞的活力。结论 CrisprCas9慢病毒干扰系统可以稳定敲除SDC1的表达，并显著抑制U266细胞的活力。

【关键词】CrisprCas9系统；SDC1；骨髓瘤；增殖

【中图分类号】R733.3 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095.6681.2018.08.23..02

多发性骨髓瘤是一种极其恶性的血液系统疾病，显著特点是浆细胞的克隆性增殖[1]。近年来，很多新的治疗因子被批准用于治疗难治复发性骨髓瘤患者，如硼替佐米，来那度胺，沙利度胺等[2-3]。然而，由于其严重的化疗耐受作用，多发性骨髓瘤仍然是难以治愈的。因此，阐明骨髓瘤的发病机制，寻求新的靶向治疗药物是当前骨髓瘤研究的热点问题。蛋白多糖Syndecan 1（SDC1）是骨髓瘤发生的重要标志分子之一，位于细胞表面，又称之为CD138。目前，多种研究证实SDC1与结直肠癌和神经胶质瘤的发生发展密切相关[4-5]。本研究拟利用CrisprCas9慢病毒系统沉默SDC1基因的表达，探索其对骨髓瘤细胞增殖的影响，为寻找骨髓瘤治疗新靶点奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1640培养基（Sigma公司），胎牛血清（Gibco公司），Trizol（Takara公司），SDC1，β-actin一抗和二抗购买于Proteintech公司，CD138流式抗体购买于BD公司，RPMI-8226，U266和IM9细胞购买于美国菌种保存中心。

1.2 方法

1.2.1 蛋白免疫印迹（western blot）

用RIPA强裂解液提取目的细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量（凯基生物）。每次取10 μl总蛋白进行10% SDS-PAGE凝胶电泳（80 V 40 min，120 V 60 min），并将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜（100 V 120 min）。5%脱脂奶粉封闭1 h。按照1：1000比例稀释SDC1，1：5000稀释β-actin，4℃孵育过夜，按照1：2000稀释兔二抗和鼠二抗，室温孵育1 h，随后用ECL显色底物显影。

1.2.2 实时荧光定量PCR（Q-PCR）

TRIzol法提取U266细胞总RNA，取1.5 μg RNA进行反转录。反应条件：25℃，10 min；37℃，90 min；85℃，5 min。反转录产物于-20℃保存。定量PCR引物序列如下：SDC1正向引物：CGTGGGGCTCATCTTTGCT，反向引物：TGGCTTGTTTCGGCTCCTC。β-actin为内参。反应体系：SYBR GreenⅠmix10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物（2μM）各3 μl，RNase- free水补足至20 μl。反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。

1.2.3 流式细胞术

正常收取细胞，计数每个样品细胞数在1×106个。用100微升FACS buffer重悬样品细胞，冰浴10 min，加CD138-BV421抗体2微升，轻轻婚姻，冰上孵育30 min，期间避光放置。然后加上1 ml FACS buffer 1500rpm离心5 min，洗涤2次，随后用500微升FACS buffer重悬细胞，上机检测。

1.2.4 CCK8法测细胞活力

将对照细胞和沉默SDC1基因表达的目的细胞密度调整为1×105个/ml，每孔接种100 μl细胞悬液，每组设置3个复孔，经不同时间点处理（24 h，36 h，48 h，72 h），加入CCK8 5μl避光处理3 h，随后利用酶标仪测定450nm波长的吸光度值，进行3次独立重复实验，计算活力变化情况。

1.2.5 统计学分析

利用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，组间比较使用独立样本t检验，P<0.05表示差异显著，具有统计学意义。

2 结 果

2.1 SDC1在多种骨髓瘤细胞中的表达情况

我们利用Q-PCR技术分析了SDC1基因在RPMI-8226，U266和IM9细胞中的表达情况，结果分析SDC1在RPMI-8226表达较低，在U266和IM9细胞中表达较高（图1）。

随后，我们用U266细胞沉默SDC1基因，进行后续实验。

2.2 SDC1在U266细胞中沉默效率的验证

我们利用CrisprCas9慢病毒干扰系统沉默SDC1基因的表达，通过Q-PCR实验证实SDC1敲除效率在70%以上（图2A）。进一步蛋白免疫印迹实验证实，CrisprCas9慢病毒干扰系统有效沉默SDC1蛋白的表达（图2B）。

2.3 流式细胞术分析CD138标志分子的变化情况

沉默SDC1基因表达以后，我们进一步利用流式细胞术检测了U266稳定沉默SDC1细胞株的SDC1阳性细胞率，结果显示沉默SDC1后CD138阳性细胞显著降低（图3），为后续研究奠定坚实基础。

2.4 沉默SDC1后对细胞增殖的影响

我们利用已建立稳定沉默SDC1基因的U266细胞系，通过CCK8法检测了不同时间点U266 control組及ko SDC1组的细胞活力情况，结果发现沉默SDC1后明显抑制U266细胞的活力（图4）。

3 讨 论

Syndecan （SDC）是一类进化上保守的I型跨膜糖蛋白，可以结合多种配合和受体，如FGFs，VEGFs，TGF-β，PDGFs，integrin以及VEGFR等。而SDC1是目前研究最广泛的成员之一，其在肿瘤细胞中的差异表达与肿瘤发生和临床预后密切相关[6-7]。Xu等人发现胶质瘤中SDC1的表达与恶性进程和不良预后呈正相关，暗示SDC1在胶质瘤发生过程中可能扮演重要角色[8]。最近有研究报道称，在结肠炎诱导的结肠癌的小鼠模型中，干扰SDC1可诱导肿瘤的生长[4]。也有研究发现SDC1可能会调控粒层细胞的分化以及卵泡发育[9]。而SDC1在骨髓瘤进程中扮演什么角色呢。

SDC1（CD138）在恶性浆细胞中高水平表达，在疾病进程中发挥重要作用[10-12]。抑制SDC1表达促进TRAIL诱导的骨髓瘤细胞凋亡[13]。CD138是恶性浆细胞的重要标志分子，常用于骨髓瘤细胞的分离纯化。最近有研究分析了正常氧和低氧胁迫条件下CD138分子的表达变化，分析低氧胁迫可以降低CD138的表达，与疾病进展密切相关[14]。本研究首先利用Q-PCR检测了多种骨髓瘤细胞中SDC1基因的表达情况，采用CrisprCas9慢病毒敲除技术[15]。建立稳定敲除SDC1表达的U266骨髓瘤细胞系。利用蛋白免疫印迹实验，Q-PCR及流式细胞术等手段检测SDC1敲除效率。通过CCK8法分析分析敲除SDC1表达抑制骨髓瘤细胞的活力。

由于SDC1调控的靶基因较多，而SDC1也是骨髓瘤患者临床检测的重要标志分子之一，对其参与骨髓瘤进程的具体机制并不十分明确，SDC1基因是如何影响骨髓瘤细胞的增殖，还需要更加深入的研究。本研究建立的CrisprCas9技术沉默SDC1的载体可以有效的沉默靶基因的表达，为进一步探究SDC1基因的功能奠定基础，SDC1有望成为临床治疗难治复发性骨髓瘤患者的重要潜在靶点。

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本文編辑：吴 卫