食用植物油中黄曲霉毒素B1前处理方法的改进研究

宗 芳

（南平市粮油质量监测站,福建 南平 353000）

1 引言

黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉（aspergillus flavus）寄生曲霉（a.parasiticus）产生的次生代谢产物[1]，在粮油作物和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。据悉，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡[2]，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌物，毒性比砒霜大68倍，仅次于肉毒霉素[3]。黄曲霉毒素B1易溶于多种有机溶剂中（如氯仿、丙酮、甲醇和乙醇），在水中溶解度很低。植物油因为储存不当，常被真菌污染，导致其黄曲霉毒素含量超标。

目前黄曲霉毒素前处理的方法主要是样品经过提取、过滤、稀释，然后将样品的提取液缓慢通过免疫亲和柱，目标组分和抗体结合后，洗涤除去杂质，最后用甲醇洗脱目标组分，然后进行相关分析[4]。该方法操作可以有效除去样品中的杂质，但是存在试验成本高、试验耗时的问题。根据生物毒素检测方法高效率、低成本、前处理简单的发展要求趋势，该研究建立了针对食用植物油中黄曲霉毒素B1前处理方法的简化改进，并进行方法的比对，保证试验的精密度、准确度和回收率要求。

2 试验部分

2.1 试剂盒材料

（1）甲醇：色谱纯；

（2）超纯水：屈臣氏；

（3）氯化钠：分析纯；

（4）黄曲霉毒素B1标准母液浓度1µg/mL；

（5）黄曲霉毒素B1标准储备液：从母液中吸取500µL到10mL棕色容量瓶中，甲醇定容到刻度，即中间液；（20倍稀释）

（6）黄曲霉毒素B1标准工作液：精密量取储备液1mL，置25mL量瓶中，用50%～70%甲醇稀释至刻度，即得；（稀释25倍）

（7）PBS缓冲溶液（pH=7.4）；

（8）0.05%碘溶液。

2.2 仪器和设备

（1）高校液相色谱仪：配有荧光检测器（日本岛津）；

（2）分析天平：感量0.0001g和感量0.01g（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；

（3）高速均质器（18000r/min～22000r/min）；

（4）离心机：转速转速11000r/min（湖南可成仪器有限公司）；

（5）涡旋混合器；

（6）玻璃纤维滤纸；

（7）黄曲霉毒素B1免疫亲和柱（60mg/3mL）；

（8）全自动固相萃取装置(Fotector Plus SPE)。

2.3 样品前处理

2.3.1 直接萃取法

准确称取25.0g样品，加入5g氯化钠，准确加入甲醇+水（7+3）100mL，以均质器高速震荡提取2min，离心，经过玻璃纤维滤纸过滤。样品中，黄曲霉毒素B1含量高的情况下，定量取滤液进行适当稀释再用玻璃纤维滤纸过滤，过滤后的溶液过0.22um的针筒微孔滤膜，供高校液相色谱测定。

2.3.2 免疫亲和柱净化法

此次试验采用全自动固相萃取仪，参照GB 5009.22-2016试样进行提取，然后通过全自动固相萃取仪进行净化洗脱。以3mL/min的速度精确上样46mL待测液, 5mLPBS缓冲溶液润洗样品瓶，10mL水淋洗，气推50mL吹干免疫亲和柱，推速为160mL/min；最后以1mL的甲醇，以0.3mL/min的速度洗脱样品，以1mL的去离子水快速洗脱，收集结束后加入去离子定容至2mL，供高校液相色谱测定。

2.4 高效液相色谱条件

（1）色谱柱：C18 柱：5µm，4.6mm×250mm；

（2）流动相：甲醇+水=55+45；

（3）流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；

（4）柱后碘衍生溶液：0.05%碘溶液；

（5）衍生溶液流速：0.2mL/min；

（6）衍生反应池温度：70℃；

（7）激发波长：360nm；发射波长440nm。

3 结果与讨论

3.1 样品直接萃取方法前处理

黄曲霉毒素分析最大误差来源主要是样品的收集和取样过程，其中取样占70%，样品前处理占30%，仪器分析方面误差几乎微弱不计。分析某一批次样品中黄曲霉毒素含量，首先要保证样品收集和取样具有代表性。对于食用植物油，样品基底相对简单，常温下为液体状态，在保证取样规范的基础上，前处理过程极为关键。针对基底相对简单的食用植物油，文中采用直接溶解萃取的方法。前处理采用高速均质器，转速达到20000转以上高速震荡、充分萃取2分钟，快速提取毒素，提高萃取效果，不会造成过多干扰物质产生。滤液在经过稀释定容的过程中，如果出现浑浊的情况，必须要解决，可用两层玻璃纤维滤纸再次进行过滤。

3.2 固相萃取操作注意

固相萃取中洗脱速度是影响回收率的主要因素。洗脱量以1mL为宜。采用1mL/min的洗脱速度，洗脱效果不佳，回收率在50%～70%；继续降低洗脱速度至0.5mL/min，洗脱效果有明显提升，回收率在70%～90%；继续降低洗脱速度至0.2mL/min～0.3mL/min，回收率可稳定在90%以上。因此在固相萃取过程中要严格控制好洗脱速度。

3.3 两种前处理方法回收率和精密度对比

取三种食用植物油进行加标回收测试，1#测试样品为芝麻油，2#测试样品为花生油，3#测试样品为花生油。对三种样品分别进行添加量为1.00μg/kg、5.00μg/kg以及20.00μg/kg的加标回收测试试验，三组样品分别通过上述两种方法步骤的前处理净化，前处理结束之后在相同色谱条件下，同时进行高效液相色谱的批处理数据分析。同一样品两种不同前处理方法提取液上机色谱图对比如图1和图2所示。

图1 免疫亲和柱全自动固相萃取法色谱图

图2 有机溶剂直接萃取法色谱图

样品回收率情况如表1所示。

表1 样品回收率情况

由结果所示，样品中黄曲霉毒素B1采用直接萃取的方法，回收率为97%～104%，相对标准偏差在1.13%～2.64%。采用过免疫亲和柱全自动固相萃取的方法，黄曲霉毒素B1的回收率为90.0%～95.8%，相对标准偏差在0.85%～1.48%。两种前处理的方法得到的回收率都满足试验要求[5]，试验结果精度和准确度较高。采用有机溶剂直接萃取的方法可以有效节约成本，操作简单、易于上手。采用免疫亲和柱全自动固相萃取方法，实际操作过程中要充分熟练，严格控制缓冲液的PH、淋洗速度以及洗脱速度，稍有不慎，就会影响试验回收效果，无法保证准确度。

4 结论

高效液相色谱法检测食用植物油中的黄曲霉毒素B1，样品的前处理可以采用有机溶剂直接提取过滤的方法，不经过免疫亲和柱净化富集，也可以满足试验要求。样品处理简单，试验成本低，而且易于操作，尤其在对固相萃取操作不熟练的情况下，该方法相对简单、快速、高效，适合企业以及检验机构初检筛选或者新手操作。该研究已经通过大量试验证实，对于基质简单的植物油来说，直接提取过滤上机检测的方法，试验灵敏度、准确度、精密度以及回收率都能满足要求，该方法也通过了多家实验室间比对，操作稳定、结果可靠，具有一定的可操作性。对于基质复杂的饲料或粮食制品，该方法尚不适用。