不同真菌发酵对花生秸秆营养含量及酶活性的影响

刘纪成， 刘 佳， 张 敏， 刘锦妮*， 赵云焕， 吴海港， 姬万民

（1.信阳农林学院，河南省大别山区生态畜禽健康生产工程研究中心，河南信阳 464000；2.瑞普（天津）生物科技股份有限公司，天津空港经济区 300308）

花生是重要五大油料作物之一，也是我国重要的经济作物之一（王俊宏等，2010）。河南省是全国第一花生生产大省，种植面积1500多万亩，总产量450多万吨，花生秸秆产量300～400万吨，产量丰富（聂胜委等，2015）。花生秸秆质地松软且营养物质丰富，其粗蛋白质含量约6%～20%、粗脂肪约2%～3%、碳水化合物（主要是粗纤维）约46% ～48%（刘纪成等，2017）。但在生产中，花生秸秆在动物饲料中应用有限，大部分被直接焚烧或腐解还田，不仅浪费了资源，还严重污染环境。究其主要原因是由于花生秸秆中含有大量的纤维素，畜禽对其消化利用率低，从而影响畜禽生产性能（高靖等，2014）。因此，提高花生秸秆的消化率是未来花生秸秆资源饲料化的关键之一。

农作物秸秆的加工处理方法主要有物理机械法、化学处理法及生物处理法。有研究表明，秸秆中添加合适的微生物后，通过微生物发酵生产单细胞蛋白，可提高畜禽对秸秆的适口性及消化率，减少饲料成本及环境污染 （毛建红等，2017）。目前，利用玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆等为能量生产蛋白饲料的报道较多，而花生秸秆的报道较少。本试验选择不同微生物对花生秸秆进行发酵，研究发酵对花生秸秆营养含量及酶活性的影响，探讨其降解花生秸秆纤维物质的能力，旨在为花生秸秆的开发利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料及菌种 花生秸秆：从信阳市平桥区宏润家庭农场中取无霉变干花生秸秆，用饲料粉碎机加工成粉末状。

菌种：本试验所使用的绿色木霉（109个/g）、黑曲霉（109个/g）、黄孢原毛平革菌（109个/g）、米曲霉（109个/g）、产朊假丝酵母（1010个/g）、里氏木霉（109个/g）由山东长泰生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备 MBJ-80B培养箱（天津赛得利斯科技有限公司）；YXQ-LS-100A压力蒸汽灭菌器（济南鑫贝西生物技术有限公司）；SW-CJ-2FD洁净工作台 （苏州安泰空气技术有限公司）；K1100全自动凯氏定氮仪 （济南海能仪器股份有限公司）；UV-1810紫外分光光度计（北京普析科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 花生秸秆前处理 将制备好的发酵饲料装入500 mL罐头瓶中，每个瓶内均装花生秸秆100 g，然后加入蒸馏水，使水分含量达到65%，用牛皮纸包好，放入高压锅中121℃高压灭菌30 min后取出，于洁净工作台上放置至室温，备用。

1.3.2 试验设计 试验分为7组，即试验1～6组和对照组，对照组花生秸秆不加真菌，6个试验组花生秸秆分别接种绿色木霉、黑曲霉、黄孢原毛平革菌、米曲霉、产朊假丝酵母、里氏木霉，接种量为5%，每组设12个重复，30℃恒温对花生秸秆进行固态发酵。

1.3.3 样品的采集 分别在培养5、10、15 d时取样，每次取三个罐头瓶，取出的样品放入恒温培养箱中40℃烘干备用。

1.3.4 营养成分的测定 微生物发酵秸秆的粗蛋白质（CP）、粗纤维（CF）、粗灰分（CA）测定根据GB/T6435-86、GB/T6432-86、GB/T6434-86 标 准进行。微生物发酵秸秆的中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维 （ADF）测定根据GB/T6438-86、GB/T6438-86标准进行。

1.3.5 酶活性测定 纤维素酶（CMC）活性、淀粉酶活性均采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸）法测定。

1.3.6 还原糖测定 还原糖含量测定采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法，在 5～50 mg/mL范围内，葡萄糖线性方程为 y=0.014x+0.099（n=6，r=0.9975）。

1.4 数据处理与统计分析 试验数据采用Excel 2007整理后，采用SAS 8.0软件GLM程序进行统计分析。所有数据均以“平均数±标准差”表示，以P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著的评判标准。

2 结果与分析

2.1 不同真菌发酵对花生秸秆营养含量的影响由表1可知，不同真菌发酵对花生秸秆营养含量均有一定的影响，随着发酵时间的延长，花生秸秆中 CP 含量呈现增加趋势，CF、CA、NDF、ADF 呈现下降趋势，但是发酵10 d和15 d后各营养成分之间差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比，发酵5 d后，黑曲霉、黄孢原毛平革菌、产朊假丝酵母、里氏木霉组花生秸秆的CP含量分别提高了23.90%、15.89%、12.80%、13.95%，而米曲霉、绿色木霉组花生秸秆的CP含量和对照组相比变化不显著（P＞0.05）。各组花生秸秆的CF含量较对照组分别降低了 22.56%、16.85%、25.40%、14.79%和13.58%。但米曲霉变化不显著（P＞0.05）。CA、NDF、ADF的含量较对照组有所下降，但差异不显著（P＞0.05）。和发酵5 d相比，发酵10 d后各组花生秸秆的CP含量较对照组均有所提高，分别提高了 6.28%、12.41%、7.13%、3.84%、26.95%和14.04%，CF含量分别降低 12.25%、5.18%、11.17%、3.68%、8.89%和 15.305%；和对照组相比，发酵10 d后各组花生秸秆的CP含量分别提高了 4.34%、37.68%、22.73%、3.70%、51.60%和28.61%，CF含量分别降低 28.42%、18.19%、31.13%、5.35%、19.45%和24.05%，各组花生秸秆的NDF、ADF含量均有有所下降，其中黄孢原毛平革菌发酵后NDF、ADF含量最低，较对照组分别降低了11.10%、15.56%。在发酵15 d和发酵10 d相比各营养含量差异不显著（P＞0.05）。因此，从花生秸秆成分降解情况综合考虑，发酵10 d后的效果较好。

2.2 不同真菌发酵对花生秸秆酶活性的影响由表2可知，不同真菌发酵对花生秸秆纤维素酶、淀粉酶的活性存在差异，随着发酵时间的延长，纤维素酶、淀粉酶的活性呈现先增加后降低的趋势。绿色木霉、里氏木霉发酵花生秸秆5 d后纤维素酶活性比发酵10、15 d的活性高，发酵15 d后纤维素酶活性和对照组相比差异不显著（P＞0.05）。黑曲霉、黄孢原毛平革菌、产朊假丝酵母在发酵10 d后纤维素酶活性最高，和对照组相比差异显著（P＜0.05）。各组淀粉酶活性在发酵10 d后活性最高，其中产朊假丝酵母组淀粉酶活性最强，活性是对照组的6倍以上（P＜0.05），而试验各组中淀粉酶活性在发酵15 d后显著降低。

表1 不同真菌发酵对花生秸秆营养含量的影响%

3 讨论

3.1 不同真菌发酵对花生秸秆营养含量的影响饲料中粗蛋白质、粗纤维及粗灰分是衡量饲料品质的重要指标（周明，2014）。研究表明，利用微生物对农作物秸秆进行处理后可以提高饲料中常规营养成分的含量，改变饲料的营养价值，提高饲料利用率 （陈帅，2017；韩雅慧，2016）。王雷雷等（2015）采用六种真菌对花生秸秆进行发酵处理后，花生秸秆粗蛋白质含量提高30%，粗脂肪提高1.4%，粗灰分含量降低50%，且试验结果表明不同真菌发酵后，花生秸秆的营养价值存在一定差异。李术娜等（2015）采用复合菌剂发酵花生秧粉后其粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维分别下降25.57%、11.35%、9.50%；粗蛋白质、有机酸与总能分别增加52.23%、66.34%、52.98%。宋洛文等（2001）试验结果表明，微生物发酵饲料的感官新鲜，气味酸甜，适口性好，可显著提高奶牛的产奶量，同时可以节省精料用量17.90%。本研究也证实真菌发酵对饲料品质有改善作用，采用黑曲霉、黄孢原毛平革菌、产朊假丝酵母、里氏木霉发酵花生秸秆后，花生秸秆中CP含量分别提高了23.90%、15.89%、12.80%、13.95%，CF含量分别降低了16.85%、25.40%、14.79%和13.58%。这与上述文献报道的存在一定差异，这可能与所选用的真菌不同有关，提示生产实践中可根据需要选择合适的发酵菌种。此外本试验发现花生秸秆在发酵10 d后的各营养成分变化最为明显，提示生产实践中花生秸秆发酵时间10 d为宜。

表2 不同真菌发酵对花生秸秆酶活性的影响U/g

表3 不同真菌发酵后花生秸秆的还原糖含量mg/g

3.2 不同真菌发酵对花生秸秆酶活性及还原糖含量的影响 纤维素是农作物秸秆中的主要成分，也是影响动物机体对蛋白质和脂肪等营养物质的吸收利用重要因素之一（郭红伟，2013）。纤维素酶是常见广泛存在的一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等构成，其在一定的条件下可以将不易被利用的植物纤维素水解成较小分子的纤维二糖和葡萄糖等糖类，从而提高动物对高纤维饲料的消化吸收率。淀粉酶主要促进饲料中淀粉成分的降解，提高动物机体对营养成分吸收利用（贾佳，2009）。研究表明，许多微生物可产生纤维素酶和淀粉酶，且真菌所产纤维素酶和淀粉酶产量高，活性大，能够提高畜禽对植物饲料的利用率（曾辉，2017；顾拥建，2017； 巴桑珠扎，2017； 叶川，2011）。 Huzairy 等（2014）采用枯草芽孢杆菌发酵稻秸，发酵后淀粉酶活力达到276 U/g。潘立博等（2012）使用白腐菌与酵母菌混合发酵稻草秸秆，其纤维素酶的活性呈现规律性的变化，且在发酵第6天后纤维素酶活性最强。任勰珂等（2017）报道绿色木霉、黑曲霉和假丝酵母三种菌种对玉米秸秆发酵作用最为明显，发酵3 d后，酵纤维素酶活达到85.73 U/mL。辛总秀等（2008）研究发现采用纤维素酶可以提高玉米秸秆中还原糖的含量，其含量由11.13%增加到28.66%。魏如腾（2016）采用芽孢杆菌、黑曲霉和里氏木霉三株菌发生玉米秸秆，其发酵36 h后，纤维素酶活性达到404.28 U/mL。而王雷雷（2015）采用六种真菌发酵对花生秸秆，其中三种真菌产生的酶较少，活力均较弱。而本试验中绿色木霉和里氏木霉发酵5 d后纤维素酶活性最强，其活性为220.22 U/L和207.16 U/L，而黑曲霉、黄孢原毛平革菌、产朊假丝酵母在发酵10 d后纤维素酶活性最高，且产朊假丝酵母产生淀粉酶活性最强，这与上述文献报道存在一定差异，这可能与本试验中所选择的温度、底物浓度、氮源、水分以及物理因素等多种因素有关。此外本试验还发现随着发酵时间的延长纤维素酶、淀粉酶活性及还原糖含量呈现规律性的变化，随着发酵时间的延长酶活性逐渐降低，这可能是由于采用真菌发酵秸秆时间过长，发酵菌种已经生长到旺盛期后期，引起产酶性能降低，所产的酶出现了部分失活的现象。

4 结论

本试验结果表明，在花生秸秆中添加真菌可以提高花生秸秆中的营养成分，提高产物中纤维素酶、淀粉酶活力及还原糖含量，提高畜禽机体对花生秸秆中各营养成分吸收利用，提高花生秸秆的利用率，且发酵10 d效果比较理想。