盐渍对鸭蛋的白蛋白影响

伍佰鑫 ，邓 平 ，刘成国 （编译）

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；2.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128）

盐鸭蛋又称腌蛋或咸蛋，用食盐腌制，成熟期短，费用低廉；其蛋白软嫩洁白，蛋黄松沙可口，中心油分积聚，外围油分四溢，色泽桔红或橙黄；是人们喜爱的传统食品[1]。盐鸭蛋中的蛋白含有4%～7%的氯化钠（味道感觉太咸），可采用脱盐工艺和电渗析法去除蛋白中的盐[2]。也可预先分离新鲜鸭蛋中的白蛋白（用作其它食糜原材料），直接腌制蛋黄[3]。一般情况下，鸭蛋在盐渍过程中，白蛋白的理化性质会发生改变，水分含量逐渐下降，而盐、灰分、蛋白质和脂类含量增加；随着腌制时间的延长，蒸煮全鸭蛋中的白蛋白硬度变得更低[4]。为了探索鸭蛋腌制期间（30d）白蛋白化学成分、胰蛋白酶抑制活性与凝胶特性的变化，泰国学者做了如下研究[5]，可为国内蛋品加工行业创新提供“药引子”。

1 研究方法

按 1个蛋/100ml的比例，室温（28～30℃）配制卤水或浓盐水（25%，w/v）备用。从鸭场采集新鲜鸭蛋（产出后24h内），用自来水洗干净，浸入卤水或浓盐水。每隔5d随机取出一些盐鸭蛋，手工敲碎、将白蛋白与蛋黄分离，对白蛋白进行分析。白蛋白中的水分、蛋白质和盐分含量的测定，分别采用AOAC2000、双缩尿（反应）法和 AOAC2011。运用8-苯胺-1-萘磺酸（德国）为探针，根据荧光强度对蛋白质浓度（线性回归分析）的初始斜率，计算白蛋白的表面疏水性。

胰蛋白酶抑制活性的测定：取200μl白蛋白和 200μl猪胰蛋白酶（0.05mg/ml）37℃培养 15min；添加1000μl反应缓冲液 （50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,其中含有 20mM CaCl2，pH8.2）； 添加200μl苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝基苯胺（2mg/ml，美国）；混合物 37℃培养 15min；添加 200μl的30%乙酸（v/v）；用分光光度计（日本）测量410nm处的吸光度，对ρ-硝基苯胺的释放进行监测；当酶引起吸光度增加0.01个单位/min，就定义为1个单位的胰蛋白酶活性；使胰蛋白酶活性降低1个单位，就定义为1个单位的胰蛋白酶抑制活性。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳：取2ml白蛋白与12ml 5%十二烷基硫酸钠（德国）混合（制备蛋白质样品）；取15μg蛋白质样品置于凝胶（12%电泳胶和4%积层凝胶）之上进行电泳（恒流 15mA/凝胶，美国）；用染色液（德国，0.125%考马斯蓝Coomassie blue R-125滴入25%甲醇和10%乙酸之中）对凝胶进行染色；脱色采用40%甲醇和10%乙酸；最后估算蛋白条带的分子量。

抑制活性染色：取白蛋白样品与缓冲液（不含β-巯基乙醇）混合；混合样不做热处理，分别取15μg置于2个相同的凝胶之上，通过电泳将蛋白质分离，电泳装置嵌在碎冰中以便减少产生的热量；其中1个凝胶固定，用考马斯蓝R-250染色，作为对照组凝胶；另外1个凝胶用2.5%聚乙二醇辛基苯基醚冲洗15min，去除十二烷基硫酸钠，再用蒸馏水冲洗，浸入50ml胰蛋白酶（0.2mg/ml）50mM三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中 （其中含有20mM CaCl2，pH8.2）；该凝胶 0～4℃培养 30min、置于室温60min，让胰蛋白酶扩散到凝胶中；用蒸馏水冲洗后浸入酪蛋白溶液（酪蛋白10mg/ml、50mM三羟甲基氨基甲烷的缓冲液，pH8.2），37℃培养90min；凝胶用蒸馏水漂洗、固定、用考马斯蓝R-250染色，形成抑制条带，在清晰的背景上检测暗带；通过对照组比较标准的蛋白质迁移率，估算胰蛋白酶抑制剂的表观分子量。

白蛋白凝胶制备与分析：先用蒸馏水作溶剂，制备白蛋白溶液（10%固形物），轻轻搅拌均匀；倒入套管 （直径25mm），两端都紧紧密封，加热至90℃保持30min；立即冷却至4℃并过一夜；分析之前将白蛋白凝胶切割成圆筒状（直径25mm、高度30mm）。 采用质构仪（Model TA-XT2i，英国）分析纹理轮廓：用压缩圆柱形铝探头（直径50mm）将凝胶压缩至原始高度的40%；在3mm/s的十字头速度下，记录力距变形曲线，记录速度也是3mm/s；用分析软件（MicroStable，版本6，英国）评价硬度、胶粘性、弹性、粘聚性、弹力、咀嚼性和胶质。采用色度计（ColorFlex，美国）分析凝胶的亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*）；通过公式 100－[(100－L*)2+a*2+b*2]1/2计算出白色度。用扫描电子显微镜检测腌制0、15d和30d的盐鸭蛋蛋白凝胶的显微结构：将白蛋白凝胶切成小块（1×1×1mm3），用含有 2.5%戊二醛的0.2M磷酸盐缓冲液（pH7.2，德国）固定12h；用蒸馏水漂洗1h；用6种浓度 （25%、50%、70%、80%、90%和100%）的乙醇脱水，每个浓度的脱水15min；对脱水样品进行临界点干燥；涂上一层100%金子（溅射喷涂机SPI-Module，美国）；用扫描电镜（JEOL JSM-5800LV，日本）观察凝胶微观结构。

所有试验一式三份，一共三批样品；数据采用单向方差分析（ANOVA），结果用平均值和标准差表示；采用多重比较分析样本之间的差异，统计分析软件是SPSS11.0（美国）。

2 研究结果

2.1 盐渍时间对鸭蛋蛋白化学成分的影响 盐渍期间，鸭蛋蛋白中的水分持续减少，从初期的87.93%减少到盐渍30d的81.20%；同时，盐分随盐渍时间延长而增加，从初期的0.31%增加到盐渍 30d 的 6.19%。 蛋白的亮度（L*）减少、红度（a*）、黄度（b*）和白色度增加，见表 1。

蛋白质表面疏水位点的数量和相对大小，通常决定蛋白质的溶解度，在pH、温度和离子强度等生理条件下的聚集倾向。鸭蛋蛋白的表面疏水性随盐渍时间延长而逐渐增加，从初期的735.04增加到盐渍20d的821.45，表明盐渍诱导了蛋白质构象变化。在盐渍的前15d期间，鸭蛋的胰蛋白酶抑制活性持续下降，只保持63%的活性；盐渍30d的抑制活性最低 （5.68千单位/mg固体），因此，胰蛋白酶抑制剂的变性可能与其生物活性的丧失有关，从而推断抗蛋白酶活性的降低与一些关键蛋白（如类卵母细胞和卵黄抑制剂）的退化有关。

表1 盐渍期间鸭蛋蛋白的水分/盐分/色泽变化

电泳结果发现，鸭蛋蛋白最主要的蛋白质是卵清蛋白，分子量为44kda。在非还原条件下，发现有分子量分别为81、70和16kda的蛋白质，分子量为81kda的蛋白质更可能是卵传铁蛋白，分子量为16kda的蛋白质更可能是溶菌酶。对于抑制活性染色，只保留了分子量为44kda的蛋白带，这种蛋白 （分子量类似）貌似卵清蛋白或其他蛋白质，对胰蛋白酶有抑制作用。抑制活性染色未检出类卵母细胞和卵黄抑制剂，当十二烷基硫酸钠用于电泳时，那些抑制剂可能失去了抑制活性，经胰蛋白酶消化后，那些蛋白条带未被保留。盐渍20d后，分子量为44kda的蛋白带淡于新鲜鸭蛋和盐渍10d鸭蛋的蛋白带，这表明盐渍期间，有抑制活性的蛋白质失去了一些活性，可能归因于抑制蛋白的构象发生了改变，这一结果与鸭蛋白在盐渍过程中降低了胰蛋白酶抑制活性是吻合的，也就是说，盐渍时间对降低胰蛋白酶抑制活性有显著影响。

2.2 盐渍时间对白蛋白凝胶特性的影响 随着盐渍时间的增加，白蛋白凝胶的硬度降低 （P＜0.05）；新鲜鸭蛋的白蛋白凝胶硬度值（19.08N）最高，盐渍30d鸭蛋的白蛋白凝胶硬度值（3.77N）最低，差异显著（P＜0.05）；盐渍5d鸭蛋的白蛋白凝胶硬度值（9.26N）就降低了50%，见表2。

表2 盐渍期间鸭蛋的白蛋白凝胶质地变化

与盐渍鸭蛋的白蛋白凝胶相比，新鲜鸭蛋的网络更加密集、空隙更小；盐渍鸭蛋的白蛋白凝胶有较大的空隙，盐渍15d的白蛋白凝胶网络变得较粗糙，均匀度较低；盐渍30d与盐渍15d的白蛋白凝胶质地没有明显差异，但由于盐渍 （特别是30d）白蛋白中的蛋白质浓度更低、盐分含量更高，蛋白质之间的相互联系变得越来越少 （图1），这与蛋白质网络强度降低（表2）是吻合的。

图1 鸭蛋的白蛋白凝胶扫描电镜照片（放大 1万倍/比例尺 5μm）

总而言之，盐渍影响鸭蛋的白蛋白化学组成和凝胶特性，特别是蛋白酶抑制剂受盐渍时间影响，盐渍可将胰蛋白酶抑制活性减少到一定的程度。分子量为44kda的蛋白质在鸭蛋的白蛋白中充当胰蛋白酶抑制剂的角色。随着盐渍时间的延长，白蛋白的胶性变得更弱（吃起来感觉无韧性）、白色度增加。盐渍白蛋白可应用于鱼糜或其他肉制品，通过强化胶粘性、抑制蛋白质水解，改善其适口性等特性。