雌激素受体对人乳腺癌细胞MDA—MB—231生长的影响研究

李扬

【摘要】目的：通过使用三氧化二砷（As2O3）诱导雌激素受体（estrogen receptor，ER）的再次表达，通过对乳腺癌细胞生长曲线的研究来探讨ER在阴性乳腺发展过程中的作用。方法：本研究以ER阴性的人乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象，采用免疫组化、生长曲线检测法等生物学方法来检测ER在阴性乳腺癌发展过程中的作用。结果：以MCF-7作为阳性对照，免疫组化结果显示，As2O3可以诱导ER的再次产生。进一步观测MDA-MB-231细胞的生长曲线，发现ER可明显抑制其生长，与对照组相比，有显著性差异（P<0.05）。结论：ER的再表达可抑制阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长。

【关键词】乳腺癌；雌激素受体（ER）；肿瘤生长

乳腺癌（breast cancer）是女性人群中常见的恶性肿瘤，严重危害着女性健康。在中国，乳腺癌已经占到了各种恶性肿瘤的10%左右，而且随着生活环境的改变，发病率也呈逐年上升的趋势[1]。越来越多的研究证实，雌激素在女性乳腺癌发展过程中有关键性作用，显示乳腺癌的发展具有雌激素依赖性。雌激素主要通过雌激素受体（ER）发挥作用，与乳腺癌的生长密切相关，ER的表达量过低可促进乳腺癌细胞的增殖、转移，甚至抑制乳腺癌细胞的凋亡[2]。其可作为评估乳腺癌治疗的激素依赖性和预测内分泌治疗效果的分子标志物。

目前临床上，对于ER阳性的乳腺癌患者多采用抗雌激素、雌激素撤除等办法来进行内分泌治疗。但有研究报道，目前还有1/3的乳腺癌患者属于ER阴性，这些患者对内分泌治疗不敏感，而且预后差。因此如何使ER阴性的乳腺癌细胞再次表达ER以及其表达后对乳腺癌发展的影响研究便对临床有着重要的意义。

本研究以ER阴性的人乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象，使用国内最早报道用于诱导治疗的化学物质AS203诱导ER的再次表达，通过对乳腺癌细胞生长曲线的研究来探讨ER在其发生、发展过程中的意义，以期为ER阴性乳腺癌患者的治疗提供一条新的思路。材料与方法

1.1 材料

细胞株：ER阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购买于上海细胞库；ER阳性人乳腺癌细胞株MCF-7购买于山东大学保藏中心。

主要试剂：三氧化二砷（AS203）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

雌激素受体（ER）阳性人乳腺癌细胞株MCF-7，常规培养；雌激素受体（ER）阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231常规培养，将对数生长期的MDA-MB-231细胞调整细胞浓度为 5×105/mL，换含AS203的培养液，至AS2O3终浓度分别为5.0μmol/L，连续培养48小时。

1.2.2 实验步骤

免疫组化：（1）细胞爬片。取对数生长期的细胞进行常规消化制成单细胞悬液，加入到预先已经放置盖玻片的24孔板中，每孔加入预先计算的细胞悬液量，放入培养箱中进行培养。培养24h后，取出盖玻片，PBS洗干净，风干。冷丙酮固定10min.（2）加入3%HZOZ适量，37℃，30min，以用来清除内源性过氧化物酶的影响；洗干净；山羊血清封闭；加入ER抗体，过夜；洗干净，加辣根酶标记的链霉卵白素，37℃，30min，洗干净；DAB显色，显微镜下观察；自来熟洗涤，苏木素染色，冲洗反蓝；酒精脱水，二甲苯透明，封片。用PBS代替一抗制成阴性对照。MCF-7作为阳性对照。

Westem Blot实验：（1）提取细胞的总蛋白。收集经过不同处理的尽量多的细胞，预冷的1×PBS洗3次，800g，离心5min/每次。弃上清，加入细胞裂解液适量，置于冰上裂解10min，每隔2min吹打一次，800g，离心5min。（2）吸取上清利用己准备好的标准曲线计算出浓度并进行WB实验。

生长曲线实验：将对数生长期的MDA-MB-231细胞调整细胞浓度为5×105/mL，换含As2O3的培养液，至As2O3终浓度分别为5.0μmol/L，连续培养48h。采用电子监控技术监测其生长变化。

1.3 判定结果染色为阳性的细胞为

细胞或者细胞浆会出现黄棕色颗粒。

1.4 统计分析

采用SPASS统计软件。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞阴性检测

与阳性对照MCF-7相比，MDA-MB-231乳腺癌细胞AS2O3处理前免疫组化结果显示为阴性，染色部位主要为胞浆少量表达，颜色较浅；在As2O3处理后，主要表达在细胞核和胞浆，颜色较深，说明ER重造成功，结果如图1所示。

2.2 MDA-MB-231乳腺癌细胞ER的蛋白表达情况

Westem Blot结果如图2所示，ER呈阴性的MDA-MB-231细胞株，ER不表达，而经As2O3处理后，MDA-MB-231细胞株ER表达，但与阳性细胞株MCF-7相比较，其表達量较低。

2.3 ER对MDA-MB-231乳腺癌细胞株生长曲线的影响。

实验分为两组（contrl组，即未经As2O3处理；实验组，经As2O3处理），采用电子检测探究ER对MDA-MB-231乳腺癌细胞株生长曲线的影响。结果如图3所示，处理后细胞生长曲线变得平缓，细胞生长受到抑制，提示我们或许ER抑制了MDA-MB-231细胞的生长。

3 讨论

ER蛋白是否表达是乳腺癌临床激素治疗的一个肿瘤标记物。在临床中，对于ER阳性乳腺癌会采用抗雌激素的手段来进行治疗。但还有约1/3的乳腺癌患者在初次诊断时，ER表达呈现阴性而无法得到治疗，因此是否可以将这些患者由ER阴性转化为阳性进而使用内分泌疗法进行治疗。

Baj等[3]，报道砷剂对乳腺癌细胞株有诱寻凋亡的作用。Karasulu等[4]报道低浓度As2O3对正常机体细胞影响很小，但可以引起乳腺癌细胞系MCF-7的凋亡。Chow等[5]实验研究结果表明，As2O3可明显抑制乳腺癌细胞系MCF-7的生长。同时具有下调肿瘤细胞Bcl-2的表达以及上调p53基因表达的作用。魏玲等[b]通过实验得出As2O3在体外可显著抑制乳腺癌胞株MDA-MB-231细胞生长并引起凋亡，其机制可能与阻滞细胞周期有关。As2O3诱导ER再次表达已经有相关报道。

本研究中采用As2O3对ER阴性的人乳腺癌细胞进行处理，使之重新表达ER。从免疫组化和WB结果可以看出，As2O3确实可以诱导ER的再次表达，但对于其具体机制还需要进一步研究。已经有研究报道，这可能与ER基因CpG岛异常甲基化有关[7-9]。总结目前的研究其机制可能有：（1）ER基因的启动子区域高度的甲基化，使得相关的基因转录因子不能结合到该区域；（2）高度甲基化的启动子区域与组蛋白乙酞化状态有关，染色体结构改变，导致其不易被转录[10，11]。生长曲线结果提示我们ER可抑制乳腺癌细胞的生长，这或许可以为临床治疗ER阴性患者提供一定的思路。

目前我们正在进行更进一步的研究，来进一步探究As2O3诱导ER再次表达的机制以及其对内分泌治疗的反应性。已经有研究发现As2O3可诱导MDA-MB-231乳腺癌表达ERα，并且这种表达是有效表达，能够使MDA-MB-231细胞系ERα基因中CpG岛发生去甲基化。之后使用他莫昔芬（TAM）进行治疗时，细胞增殖受到明显限制[12]。这也提示我们阴性乳腺癌患者不表达ER可能是因为基因岛的异常甲基化有关，可能与基因突变、缺失等无关，这或许为ER阴性乳腺癌患者的治疗提供了一条新的思路。我们将进一步将实验扩展到体内，采用动物试验和临床试验进一步研究，以期为临床治疗ER阴性的乳腺癌患者提供福音，为医护人员提供一定的理论支撑。

参考文献

[1]Zheng G，Peng F，Ding R，etal.Identification ofproteins responsible for themultiple drug resistance in5-fluorouracilinduced breastcancer cell using proteomicsanalysis[J].Cancer Res ClinOncol，2010，136：1477-1488.

[2]王海霞，解其贵，赵俊红等.子宫内膜癌雌激素受体α、β和孕激素受体mRNA与临床病理的关系[J].中国临床医学，2008，15（06）：863-865.