榴莲冻肉中污染微生物的分离鉴定和低温存活时间研究

（绿城农科检测技术有限公司，浙江杭州310052）

榴莲富含丰富的蛋白质、维生素及矿物质等，被誉为“水果之王”，但其一旦成熟就不易保存，目前最好的保存方式就是采用深冻技术延长榴莲保鲜期，也就是榴莲冻肉，它是水果糕点制品的原材料之一，但仍然逃不过微生物的污染。食品中的生物性污染在国内外都是影响食品安全的最主要原因，食源性致病菌是食物中毒和食源性疾病暴发的重要因素，也是食品安全的重要风险隐患[1]。微生物造成的威胁有两方面：一是微生物毒素或病原微生物对消费者的健康构成威胁，二是食品腐败造成经济损失[2]。我国的食品安全国家标准对糕点面包等，均规定微生物限量，控制项目包括菌落总数、大肠菌群、霉菌、及食源性致病菌[3]。食物污染来源的调查研究显示，不合理的运输也会导致各类食物甚至非食物类物品间的交叉感染[4]。当榴莲水果冻肉进行微生物检测时，菌落总数仅代表卫生指标，但无法明确菌株类别，有必要进行鉴定以明确其污染源。

目前，在食品检测中细菌鉴定采取传统手工生化鉴定、半自动或全自动鉴定仪如ATB细菌鉴定仪、VITEK系列鉴定系统等。而在医疗领域，由于大量的临床标本需要快速鉴定，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix－assisted laser sesorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS）应用微生物鉴定以其快速、准确、成本低而占具优势[5]。食品中出现微生物污染水平较高时，运用该方法进行鉴定较少。试验采用传统肠道杆菌及其它革兰氏阴性菌鉴定试剂条（API 20E）和链球菌及有关菌鉴定试剂条（API 20Strep）方法结合 MALDI－TOF－MS 方法，鉴定三类菌落形的细菌，分别为明串珠菌属，粘质沙雷氏菌和阴沟肠杆菌。了解榴莲冻肉的污染菌后可以针对它们的来源进行防控措施。粘质沙雷氏菌广泛分布于土壤及水环境中，其产色素的培养温度为20℃～36℃，颜色最红为30℃和28℃，这个结果与已有文献报导保持一致[6－9]。据报道这是因为粘质沙雷氏菌生长需要矿质元素钾、钙而 K+、Ca2+、Cu2+和 Mn2+能显著提高色素产量[7]；而榴莲营养成分中富含人体所需的丰富矿物质元素，如钾、钙、铁、镁、锰、铜等矿质元素[10]。因此，可以通过选择产色素的温度作为与其它细菌有效分离的温度。阴沟肠杆菌是肠杆菌科肠杆菌属的成员之一，该菌广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便、水、泥土、植物中均可检出阴沟肠杆菌，是肠道正常菌种之一，作为条件致病菌成为人类医院感染重要的病原菌[11]。阴沟肠杆菌常产生β内酰胺酶，它是导致1代～3代头孢菌素、单环β－内酰胺类及含酶抑制剂的复合制剂耐药的重要原因[12]，因此避免因食品污染而感染尤为重要。明串珠菌分布于自然生态环境中绿色植物的地上部分和根，但与需氧细菌和酵母相比数量少（＜1%），来源于自然环境的明串珠菌在蔬菜、饲料和多种发酵食品等各种植物材料中容易繁殖[13]。因此，防范从源头入手，探索该类水果中微生物检测鉴定方法的同时，研究污染微生物的低温存活时间，为人们进行榴莲水果食品安全生产运输保藏提供理论信息。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品来源

榴莲冻肉：产地泰国，杭州市售。

1.1.2 培养基

平板计数琼脂（platecountagar，PCA）、氯化钠胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA）、营养琼脂培养基（nutritional agar，NA）：青岛高科技园海博生物技术有限公司。

1.1.3 试剂

API 20 E肠杆菌及G－菌、API 20 Strep链球菌生化试剂：生物梅里埃中国有限公司；氧化酶试剂、触酶试剂、革兰氏染色液试剂等其它生化试剂：青岛高科技园海博生物技术有限公司。

1.1.4 仪器

MALDI－TOF MS Clin－ToF－II基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统：北京毅新博创生物科技有限公司；LRH－250F型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；GI80TW型高压灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；HFSafe－1500LC II级A2型生物安全柜：上海力申科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌落总数测定

称取25 g样品至225 mL 0.85%无菌氯化钠溶液，取此培养液1 mL加0.85%无菌氯化钠溶液9 mL，采用10倍递增稀释法，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，倾注平板计数琼脂培养基，于（36±1）℃倒置培养 48 h。

1.2.2 分离纯化

选取适宜稀释度的平板，按不同菌落形态的细菌，分别划线接种TSA，30℃～35℃培养24 h。产色素的菌株，设置不同温度进行分离培养，确定产色素温度范围和优选最适温度。分离的菌株通过菌落形态观察、纯化、染色镜检后分别保存于25%甘油溶液和瓷珠中，作为供试菌株用于后续试验。

1.2.3 鉴定方法

传统方法鉴定：将适宜稀释度的单个菌落，按不同菌落形态细菌分别分离划线于氯化钠胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基（TSA）上，置36℃培养18 h～24 h，挑取单菌落通过革兰氏染色、镜检，革兰氏阴性杆菌接种到API 20E生化鉴定条，链球菌接种API 20 Strep板条，36℃培养24 h，读生化结果。

MALDI－TOF－MS 用 1 μL 接种环直接挑取单个菌落点涂抹在金属靶板上，滴加1 μL基质液（50%乙腈与2.5%三氟乙酸混合配制的饱和α－氰基－4－羟基肉桂酸溶液），室温晾干后将靶板放入MALDI－TOF－MS仪检测。同时每次试验用大肠埃希菌DH5α的蛋白抽提液作为校准品和阳性对照。

1.2.4 污染菌的低温存活时间研究

将第一次检测完的样品于－20℃保存，然后每隔2个月按1.2.1进行菌落总数检测，连续监测12个月，计数并观察微生物污染情况，同时按最优的鉴定方法进行典型菌落鉴定。将－20℃保存1个月后的榴莲样品，测完菌落总数后，放入2℃～8℃冷藏，每天按1.2.1进行菌落总数检测，连续监测4 d，计数并观察微生物污染情况，同时按最优的鉴定方法进行典型菌落鉴定。

2 结果与分析

2.1 菌落总数测定

经检测榴莲冻肉样品中初始污染菌落总数平均为50 000 CFU/g。单菌落出现在1 000倍稀释梯度，挑选典型菌落共50个用于分离纯化鉴定。

2.2 分离纯化

挑取梯度中的单菌落，用TSA分离纯化得到3种不同菌落形态的细菌。一是红色大菌落（LHD），菌落占比19%；二是白色大菌落（LBD），菌落大而湿润的黏液状，菌落占16%；三是白色小菌落（LBX）菌落，菌落占比65%。因LHD1菌落出现红色，为了确认红色产生的温度范围，分离时设置了5个温度分别为15、20、28、30、36、40 ℃见图 1。

图1 不同温度下产红色素能力Fig.1 The ability to produce red pigment in different temperatures

由图1可知，红色素在菌落中分布不均匀，菌落中心先出现，随着培养时间延长，红色素分泌至整个菌落。产色素的能力范围为20℃～36℃，15℃以下，40℃以上菌落生长，但不产色素。颜色最红的是28℃和30℃，最浅的是20℃。当把20℃的平皿延长培养或移入28℃培养24 h，菌落红色加深。40℃移入28℃培养24 h出现少部分菌落产红色素。为了使其与其它细菌明显有效分开，分离纯化时选用产红色素能力最适温度30℃。

2.3 菌株鉴定

2.3.1 传统鉴定方法结果

经API 20E和API 20 Strep系统生化鉴定，并查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中描述，表明LHD型菌落共10株，有动力，具有产明胶酶和DNA酶的特性，阿拉伯糖、棉子糖和木糖均为阴性，为典型的粘质沙雷氏菌，检出率100%，置信度95.9%～99.8%。LBD型菌落共8株，其中1株出现不可接受的生化谱，不能鉴定，其它7株均为阴沟肠杆菌，鉴定置信度为92.9%～97.5%，检出率为87.5%（7/8）。LBX型菌落菌株共32株，三者中鉴定最困难的菌株，其中出现无可接受生化谱的菌株占9.4%（2/32），检出置信度低于90%的结果占25%（8/32），置信度为91.2%～98.9%的结果占65.6%（21/32），均为明串珠菌属某些种。不同菌落形态的细菌鉴定结果具体见表1和表2。50株菌经过传统鉴定法总的检出率为76%。

2.3.2 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOF－MS）鉴定结果

从分离的单个菌落开始、经涂布、上机检测读结果，每个菌在1 min～2 min内完成，操作步骤简单快速，完成50个单菌落的鉴定，仅耗时1 h。鉴定结果当置信度≥25分，表示结果可信；≤20分鉴定结果不可靠；20分～25分鉴定需通过其他辅助试验才能选出鉴定结果；试验表明50株菌包括质控菌株大肠埃希氏菌全部正确检出，检出率100%，置信度全部大于25分。相同菌落形态的污染微生物鉴定结果一致，归类成表4和图2的结果。

表1 榴莲冻肉中污染菌形态观察结果Table 1 The results of colony morphologies for contaminated bacteria in durian frozen flesh

表2 榴莲冻肉分离菌的生化试验结果Table 2 The biochemical results of bacteria isolated from durian frozen flesh

表4 榴莲冻肉中污染菌的MALDI-TOF-MS鉴定结果Table 4 The results of microbe identification in durian frozen flesh with MALDI-TOF-MS

图2 部分MALDI-TOF-MS鉴定典型图谱Fig.2 Typical chart of MALDI-TOF-MS identification of colony

2.3.3 榴莲冻肉中污染微生物存活时间

3组榴莲冻肉样品于－20℃保存下，连续监测结果见图3。

图3 冷冻（-20℃）保存榴莲冻肉中污染微生物变化Fig.3 Changes of microbial in durian fresh storage in-20℃

由图3可知，红色大菌落（LHD）存活时间为4个月，白色大菌落（LBD）存活时间为8个月，白色小菌落（LBX）存活时间大于12个月。经后续跟踪鉴定红色大菌落（LHD）为粘质沙雷氏菌，白色大菌落（LBD）为阴沟肠杆菌和白色小菌落（LBX）为明串珠菌属。

2.3.4 榴莲冻肉污染微生物冷藏下微生物的变化

污染微生物的3组榴莲冻肉样品于（2℃～8℃）冷藏，微生物变化结果见图4。

图4 冷藏（2℃～8℃）保存榴莲冻肉中污染微生物变化Fig.4 Changes of microbial in durian fresh storage in 2℃-8℃

红色大菌落（LHD）与白色大菌落（LBD）在数量级上无明显变化，而白色小菌落（LBX）细菌浓度每天都有增长，第3天达到高峰，出现数量级升至8次方，之后趋向平稳。经后续鉴定该菌为明串珠菌属。

3 结论与讨论

从榴莲冻肉中分离细菌的报导较少，试验从榴莲冻肉污染的50株微生物中分离出3种细菌：10株粘质沙雷氏菌、8株阴沟肠杆菌和32株明串珠菌属。运用了传统方法和MALDI－TOF－MS时间飞行质谱进行鉴定。比较得出传统方法检出率低仅为76%，且操作繁琐，即使是用API生化试验条，分离出单菌落后必须先做革兰氏染色涂片、氧化酶试验或触酶试验等前期鉴定，才能选择相应鉴定试条。上试条前还需要制备规定浓度的菌悬液，要求无菌操作技术严格，否则影响后续生化结果判读准确性和工作效率。其次，当某个鉴定结果不能判定时，要求做许多补充试验。再是人工判读时对生化反应的结果把握存在因人而异的主观性，易造成误判或结果不可读，试验中出现4株不可鉴定的菌株，用基质辅助激光解析电离时间飞行质谱，分别检出为1株阴沟肠杆菌和3株假肠膜明串珠菌。对于菌落形态小的明串珠菌属，传统方法鉴定较困难。而MALDI－TOF－MS试验表明，同时对一个平皿上的多个菌落进行鉴定，效率最高的是MALDI－TOFMS；只要分离到单菌落，检出率高达100%，不用重复传统方法的系列生化试验，上机后仅用3 min～5 min检出一个结果，完成50株菌仅需1 h，试验中也得出培养时间24 h和存放更长时间的单菌落，鉴定结果仍一致，不会受到细菌生长时间的影响。食品微生物鉴定中，运用MALDI－TOF－MS自动鉴定仪的方法优于传统方法，省时省力省成本。

通过分析在榴莲冻肉中污染微生物的存活周期发现，一旦榴莲冻肉被上述微生物污染，即使保存在－20℃，微生物仍然会存活较长时间。粘质沙雷氏菌和阴沟肠杆菌在－20℃低温的榴莲冻肉内存活时间为4个月和8个月；明串珠菌则时间更长，该榴莲冻肉在低温下保藏12个月后，仍检出高浓度的明串珠菌。在2℃～8℃下放置1 d至3 d，粘质沙雷氏菌和阴沟肠杆菌仍存活，但未见生长繁殖，无明显变化。而明串珠菌细菌浓度出现数量级上升。在榴莲随温度恢复到室温，存活能力强的污染菌特别是明串珠菌会迅速生长繁殖起来。可见，低温保藏时引起榴莲冻肉微生物持续繁殖的可能主要为明串珠菌。因此，榴莲水果不宜冷藏，宜冷冻。试验结果与加拿大水果蔬菜农场食品安全指南一致，在储藏过程中，应该将水果冻肉速冻以减少病原菌的生长[14]。

综上所述，榴莲水果冻肉污染的微生物用MALDI－TOF－MS鉴定，确定为粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌和明串珠菌属。粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌为条件致病菌，明串珠菌对人虽无致病性，但一旦污染会影响水果风味和营养。它们均来自大自然、水果和植物，试验研究结果给人们对榴莲水果采摘、生产，保藏提供预防污染的理论依据。另外，分离出的粘质沙雷氏菌是否为产红色素的高产菌株和基因水平的特点，以及明串珠菌在乳制品食品防腐和医药行业具有重要工业价值，但工业用途方面仍然存在菌株差异[15]，其优良特性以及抑菌性[16]有待进一步研究。