MTHFR C677T基因多态性与缺血性脑卒中合并2型糖尿病的相关性研究

翁秋燕 查芹 牛艳芳

流行病学调查显示，脑卒中已成为全球第二常见的死亡原因，我国的第一大死亡原因[1]。缺血性脑卒中约占脑卒中的80%[2]。2型糖尿病患者发生缺血性脑卒中的风险是非糖尿病患者的1.5～3倍[3]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种蛋氨酸代谢过程中产生的非蛋白氨基酸。高Hcy血症被认为是发生缺血性脑卒中的独立危险因素，约20%～50%的缺血性脑卒中患者存在不同程度的高Hcy血症[4]。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶 （5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy代谢过程中的关键酶之一。MTHFR C677T的位点错义突变可引起亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低，导致血浆Hcy水平升高。本研究分析急性缺血性脑卒中合并2型糖尿病患者的MTHFR C677T基因分布特点及Hcy水平，探讨两者与缺血性脑卒中合并2型糖尿病的关系，为进一步探索急性缺血性脑卒中合并2型糖尿病的发病机制提供依据，现将研究结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年6月至2017年5月宁波大学医学院附属医院神经内科住院的急性缺血性脑卒中患者200例。其中合并2型糖尿病患者（AIS+DM组）100例，男 59 例，女 41 例，年龄 40～82（62.46±10.24）岁。原有2型糖尿病78例，新诊断22例。不合并2型糖尿病患者（AIS组）100例，其中男56例，女44例，年龄42～85（61.09±9.59）岁。纳入标准：（1）年龄 40～85 岁；（2）脑梗死的诊断标准符合“中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010”[5]，并且经头颅 MRI检查证实；（3）2 型糖尿病均符合1999年WHO糖尿病的诊断标准。排除标准：（1）其他类型糖尿病；（2）心、肝、肾功能不全，严重感染，肿瘤，其他内分泌及自身免疫性疾病、脑血管畸形；（3）近期服用B族维生素、叶酸者；（4）原始资料不全，不配合相关检查者。另选取同期宁波大学医学院附属医院健康体检者100例为对照组，其中男55例，女45例，年龄41～83（60.84±10.52）岁。本研究获得宁波大学医学院附属医院伦理委员会同意，所有入选者均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 血生化指标检测 所有研究对象均空腹≥8h，于次日清晨空腹采肘静脉血，采用美国BECKMAN全自动生化免疫流水线检测 FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖化血红蛋白（HbA1c）、Hcy、叶酸水平。根据3组对象的MTHFR C677T不同基因型，比较各基因型亚组的Hcy水平。

1.2.2 类肝素药物治疗急性缺血性脑卒中试验（the trial of ORG 10172 in acute stroke treatment，TOAST）病因分型[6]根据TOAST病因分型，将AIS+DM组和AIS组分为5个亚型：（1）大动脉粥样硬化性卒中（large-artery atherosclerosis，LAA），（2）小动脉闭塞性卒中（small artery occlusion，SAO），（3）心源性脑栓塞（cardio embolism，CE），（4）其它确定原因引发的缺血性卒中（stroke of other demonstrated etiology，SOE），（5）原因不明性缺血性卒中（stroke of undemonstrated etiology，SUE）。根据两组患者的TOAST病因分型，比较TOAST分型亚组的MTHFR C677T基因多态性。

1.2.3 MTHFR C677T基因多态性检测 所有对象采集空腹外周静脉血5ml，EDTA抗凝，-20℃冰箱保存，备用。采用聚合酶链反应-限制性内切酶长度多态性方法（PCR-RFLP）作 MTHFR C677T 基因多态性检测：（1）基因组DNA抽提（1～1.5h）：用酚-氯仿法常规抽提基因组DNA。（2）PCR扩增C677T所在位点的MTHFR基因（2h）：以抽提得到的基因组DNA为模版，对C677T所在位点的片段进行PCR扩增。设计上游引物序列为：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCG-3′；下游引物序列为：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。PCR反应试剂盒购自北京泰百克生物技术有限公司。配制20μlPCR反应体系：10μl上述 PCR 配方、1μl全血、1μl上游引物、1μl下游引物、加水补足20μl。PCR扩增条件：95℃变性1min 后开始循环，95℃变性反应 30s，58℃退火 30s，72℃延伸反应1min，进入25个循环，最后72℃反应5min，16℃保存。（3）对PCR产物进行酶切：反应结束后进行酶切，酶切体系包含有PCR产物，HifI酶，酶切缓冲液和水，37℃水浴锅中酶切 1h。（4）电泳检测（1～1.5h）：在2.5%的凝胶上进行电泳，加入原PCR产物和酶切后的溶液以及小分子量核酸 Marker，100v恒压电泳40min。对结果使用凝胶成像仪进行拍照和记录。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用LSD-t检验，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用logistic回归分析计算OR值95%CI。用Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组对象临床及实验室指标的比较 见表1。

由表1可见，3组对象性别、年龄、TC、TG、HDL-C比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。AIS+DM组与AIS组患者的收缩压、FPG、LDL-C水平均高于对照组（t=4.760、12.961、4.440，6.345、5.254、4.914，均P＜0.05）。AIS组及对照组的舒张压、Hcy水平均低于AIS+DM组（t=1.815、6.875，3.437、8.835，均P＜0.05）。AIS组及对照组的叶酸水平均高于AIS+DM组（t=-9.635、-9.010，均P＜0.05）。

表1 3组研究对象临床及实验室指标的比较

2.2 AIS+DM组与AIS组的TOAST病因分型比较 两组TOAST病因分型中，无一例为SOE，其它4型比较见表2。

表2 AIS+DM组与AIS组的TOAST病因分型比较[例（%）]

由表2可见，两组患者的TOAST病因分型比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

此外，群体代表性检验结果发现，AIS+DM组、AIS组及对照组MTHFR C677T基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，提示样本具有群体代表性。

2.3 MTHFR C677T基因多态性分析 见图1。

由图1可见，MTHFR基因C677T经过PCR扩增后可以得到198bp长的DNA片段。PCR产物经过限制性内切酶Hin f I作用后：如果为纯合子突变（TT型），酶切后得到172bp片段；如果为野生型（CC型），酶切后仅有198bp片段；如果为杂合子突变（C/T型），酶切后会得到2个片段：包含198bp和172bp 2个片段。

2.4 3组对象MTHFR C677T基因多态性频率的比较见表3。

表3 3组对象MTHFRC677T基因多态性频率的比较[例（%）]

由表3可见，3组对象的MTHFR C677T基因型频率、等位基因频率的比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。AIS+DM组患者MTHFR C677T基因型频率与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=14.755，P＜0.05）。AIS+DM组患者T等位基因频率高于AIS组，但差异无统计学意义（χ2=11.536，P ＞0.05）。AIS+DM 组、AIS组患者等位基因频率与对照组比较，差异均有统计学意义（χ2=12.275、5.349，P＜0.05）。

2.5 AIS+DM组与AIS组患者TOAST病因分型亚组MTHFR C677T基因多态性比较 见表4。

由表4可见，AIS+DM组与AIS组患者不同TOAST病因分型亚组的MTHFR C677T基因型频率、等位基因频率分布中，在SAO亚组水平，AIS+DM组与AIS组MTHFR C677T基因型频率比较，差异有统计学意义（χ2=6.673，P＜0.05）。在LAA亚组水平，AIS+DM组T等位基因频率大于AIS组，差异有统计学意义（χ2=4.102，P＜0.05）。

2.6 3组MTHFR C677T不同基因型者Hcy水平的比较 见表5。

表4 AIS+DM组与AIS组患者TOAST病因分型亚组MTHFR C677T基因多态性比较[例（%）]

表5 3组MTHFR C677T不同基因型者Hcy水平的比较（μmol/L）

由表5可见，3组CT型、TT型对象的血浆Hcy水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。AIS+DM组CT型、TT型Hcy水平均大于AIS组及对照组，差异均有统计学意义（t=-11.448、-10.726，-15.387、-10.116，均P＜0.05）。

2.7 AIS+DM组患者多因素非条件logistic回归分析结果 以AIS合并DM为因变量Y，分别对MTHFR C677T 基因型、高 Hcy、性别、TG、LDL-C、HDL-C 等进行多因素logistic回归分析，见表6。

由表6可见，影响脑梗死合并2型糖尿病发生的独立因素为LDL-C、叶酸、高Hcy、MTHFR携带T等位基因（MTFHRC CT/T7）、高血压。从OR值来看，叶酸是保护性因素；LDL-C、高Hcy、MTHFR C677T携带T等位基因（MTFHRC CT/T7）、高血压是危险因素。

表6 AIS+DM组患者多因素非条件logistic回归分析结果

3 讨论

缺血性脑卒中是由遗传因素与环境因素共同作用的多因子疾病。传统的高危因素包括高血压、高脂血症、糖尿病、吸烟等。近年来，高Hcy血症被视为急性缺血性脑卒中发生的独立危险因素[7-8]，其在AIS的具体机制包括：（1）通过抑制一氧化氮合酶减少NO生成，对血管内皮产生毒性损伤血管内皮的舒张功能，从而影响脑梗死后新生血管及侧支循环的形成；（2）促进多种炎症介质及炎症因子的合成，激活动脉壁的慢性炎症反应，进一步导致动脉粥样硬化；（3）引起血管内皮损伤，增加泡沫细胞生成，促进动脉粥样硬化的发生、发展。

本研究显示，AIS+DM组患者的血浆Hcy水平明显高于AIS组及对照组，差异有统计学意义。多因素logistic回归分析，提示高Hcy是影响脑梗死合并2型糖尿病发生的危险因素。Zhu等[9]对165例2型糖尿病患者进行MTHFR C677T基因多态性检测，其中伴有缺血性卒中患者23例，结果显示CT型、TT型的脑卒中发生率分别为18%、21%，明显高于CC型6%，差异有统计学意义。TT型的血浆Hcy水平高于CT型及CC型。但该研究病例选择不是随机的，存在一定的局限性。赵小頔等学者[10]研究2型糖尿病合并脑梗死组的血清Hcy水平高于单纯2型糖尿病组。

高Hcy血症影响脑梗死合并2型糖尿病发生的机制尚未明确，可能包括：胰岛素通过影响Hcy代谢中的某些酶如胱硫醚B合成酶的活性增高血浆Hcy水平，从而刺激血管平滑肌细胞向血管内膜移动及增殖，加重血管内膜增生，诱发动脉粥样硬化及胰岛素抵抗[11]。Hcy与糖基化终末产物相互作用后使血栓调节蛋白分泌增加，其与糖基化终末产物在血管内皮损伤过程中相互协同[12]。

MTHFR C677T基因多态性的分布因不同地域、不同人种存在差异。本研究中T等位基因频率在AIS+DM组、AIS组及对照组分别为56.5%、50.5%、39.0%。与学者赵小頔等[10]AIS+DM组T等位基因频率64.81%研究结果相近。目前国内外关于MTHFR C677T基因多态性与脑梗死合并2型糖尿病相关性的研究尚少，结果存在争议。Zhu等[9]研究认为纯合子及杂合子中的T等位基因携带均增加2型糖尿病发生脑梗死的风险，其中T等位基因为危险因素，C等位基因可能是保护性因素。另有研究发现，MTHFR C677T TT型基因增加2型糖尿病患者发生急性缺血性脑卒中的风险[13]。Kim等[14]对韩国人群研究发现，在急性缺血性脑卒中伴代谢综合征病例组TT型基因频率显著高于单纯急性缺血性脑卒中组及正常对照组，提示MTHFR C677T基因多态性可能与急性缺血性脑卒中患者的患代谢综合征风险增高有关。本研究发现，MTHFR C677T携带T等位基因是脑梗死合并2型糖尿病的危险因素，OR值为2.387。MTHFR C677T基因突变可能与急性缺血性脑卒中合并2型糖尿病易感性相关。

MTHFR C677T基因多态性与急性缺血性脑卒中的TOAST分型之间的相关性目前仍存在争议。国内外大量研究提示MTHFR C677T基因多态性是急性缺血性脑卒中的危险因素[15-16]，而TT基因型可能导致缺血性脑卒中发生提前。欧洲学者研究发现MTHFR C677T基因突变与欧洲人群LAA相关[17]。MTHFR C677T基因多态性可能是SAO的遗传危险因子。而我们的研究发现，AIS+DM组T等位基因频率大于AIS组，但差异无统计学意义。而LAA亚组水平，AIS+DM组T等位基因频率64.9%大于AIS组的43.8%，差异有统计学意义。因此提示MTHFR C677T基因多态性与脑梗死合并2型糖尿病的TOAST分型的LAA相关。各研究结果的不同可能与地域、人种、研究方法及纳入的样本量大小相关。目前国内外关于MTHFR C677T基因多态性与缺血性脑卒中合并2型糖尿病的相关性研究尚少。

本研究探讨了MTHFR C677T基因多态性与缺血性脑卒中合并2型糖尿病的相关性，确立MTFHR C677T携带T等位基因是缺血性脑卒中合并2型糖尿病的危险因素，发病机制可能与大动脉粥样硬化有关。此结论尚需大规模临床研究进一步验证。