三七总皂甙对高脂饮食糖尿病大鼠炎症因子和主动脉脂质代谢的影响

郑建雷 李忠杰 孙渴望 王海清

冠状动脉粥样硬化是多因素作用的慢性炎症过程，其中高脂血症和糖尿病是发生动脉粥样硬化的主要危险因素[1]。既往研究发现三七总皂甙（panax notoginseng saponins，PNS）具有改善血脂代谢、减轻和延缓动脉硬化进展的作用[2]。本研究进一步探讨PNS对糖尿病和高脂饮食状态下SD大鼠炎症因子水平以及主动脉脂质代谢基因的影响，为PNS用于治疗动脉粥样硬化提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物 雄性2月龄SD大鼠46只，体重200～250g，由南京大学模式动物研究所提供，普通饲料饲养2周后，其中36只用于制造糖尿病模型。

1.2 材料和仪器 PNS（批号160902，纯度88.2%，云南昆药集团）；阿托伐他汀钙片（Phizer公司，美国）；链脲佐霉素（STZ，Sigma公司，美国）；空腹血糖、血脂水平测定（Roche Diagnostics公司,德国）；大鼠TNF-α试剂盒（北京博凌科为公司）；大鼠IL-13试剂盒（上海百蕊生物科技有限公司），大鼠IL-1β试剂盒（上海依科赛生物科技有限公司），血糖仪（强生公司，美国）。 PCR引物(北京擎科生物有限公司)；TRIzol（Gibco BRI公司，美国）；RT-PCR 试剂盒（Genecopoeia公司，美国）；SYBR Green PCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技）；PCR扩增仪（北京东胜创新生物科技有限公司）。RIPA裂解液、BCA试剂盒（上海碧云天生物技术），兔抗TLR-4（Proteintech，美国）；兔抗 SB-RI（Proteintech，美国）；鼠抗ABCA1（Abcam，英国）；小鼠单抗 β-actin、HRP 标记羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；ECL底物液（Thermo，美国）。

1.3 糖尿病大鼠建模、分组和干预 造模过程如下：大鼠禁食、禁水4h后，腹腔注射STZ溶液 [将STZ溶于0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）中，终浓度为6.5mg/ml]；每只大鼠按65mg/kg剂量腹腔注射，注射后继续禁水4h，隔日尾静脉采血，测血糖在15mmol/L以上为造模成功[3]，共成功30只，按随机数字表法分为高脂饮食合并糖尿病组（糖尿病组）、高脂饮食合并糖尿病PNS治疗组（PNS组）、高脂饮食合并糖尿病他汀治疗组（他汀组），每组10只，另10只未建模大鼠设为单纯高脂饮食非糖尿病组（对照组）。4组大鼠均予高脂饮食喂养12周。高脂饮食成分：胆固醇3.0%，胆盐0.5%，甲基硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，猪油10%，基础料81.3%。第5周起，他汀组和PNS组在每天上午分别给予阿托伐他汀钙片（美国辉瑞公司）20mg/kg体重灌胃，PNS 80mg/kg体重灌胃，对照组和糖尿病组予等量0.9%氯化钠溶液，连续8周，饲养期间饮水和饲料量不限。

1.4 大鼠体重、血糖血脂水平和血清炎症因子水平测定 记录试验前和试验结束时各组小鼠的体重。各组大鼠给予高脂饲养饮食或联合药物干预12周后处死。处死前禁食12h，不禁水，戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经心脏采血，血液经3 000r/min离心所得血清储存于-80℃冰箱中备用。分离的主动脉组织一部分用于冷冻切片，另一部分保存在-80℃冰箱，用于后续PCR和Western blot检测。空腹血糖、TC、LDL-C和TG水平的测定采用标准法使用Hitachi 912分析仪（Roche diagnostics公司，德国）。血清炎性因子TNF-α，IL-13，IL-1β水平测定根据Elisa试剂盒的说明进行。

1.5 主动脉油红染色 用干净清洁的硅化载玻片粘取冷冻切片，等到切片干燥后加入60%异丙醇浸洗10min，油红O工作液染色10min，60%异丙醇分化3～10s后水洗，Mayer苏木精复染1min，自来水返蓝，用滤纸吸干水分，甘油明胶封片。

1.6 qRT-PCR法检测主动脉组织TLR4、SR-BI、ABCA1 mRNA表达 在Pubmed上寻找基因序列：借助Premier 5.0设计引物序列（见表1）。按 Trizol Reagent（Gibco BRL，美国）试剂盒说明书提取大鼠主动脉血管总 RNA，紫外分光光度计测量OD260/OD280，计算RNA纯度和浓度。按照逆转录试剂盒（美国Genecopoeia公司生产）说明操作，将RNA反转录成cDNA，再进行PCR 扩增。反应条件：50℃，2min，95℃，10min；95℃，30s，60℃，30s，共40cycles，最后行融合曲线分析。PCR产物5μl，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过Gen Genius全自动数码凝胶图像分析系统分析各条带的光密度。荧光实时定量PCR数据：荧光实时定量PCR数据分析[采用相对性Ct（ΔΔCt）]作为定量方法进行比较，以β-actin为管家基因，校正每个样品的Ct值。

1.7 Western blot检测主动脉TLR-4、ABCA1和SR-BI蛋白表达 在每1ml冷Lysis Buffer溶液中加入5μl磷酸酶抑制剂，1μl蛋白酶抑制剂和5μl 100mM PMSF混匀，冰上保存数分钟待用。每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1ml冷Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；取组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管，4℃下12 000r/min离心5min；取上清液转移至新的预冷离心管中，即为组织全蛋白提取物，分装保存于-70℃备用，避免反复冻融。BCA法测定蛋白质浓度。蛋白加热变性，制作电泳胶，取总蛋白40μg经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2h。TBST洗膜后分别加入β-actin（1∶200）,TLR-4（1∶1 000）、SR-BI（1 ∶500）和 ABCA1（1 ∶300）一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜10min 3次，再分别加入相应的二抗，室温下振荡孵育2h。把膜移入暗室，加入ECL化学发光试剂，根据条带强弱，调整曝光时间。利用凝胶成像分析软件Bandscan进行分析。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以 表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干预后各组大鼠血脂、血清炎症因子、空腹血糖和体重比较 见表2。

由表2可见，干预前各组体重无明显差异，而干预后，糖尿病组、PNS组和他汀组体重比对照组明显降低（均P＜0.01）。糖尿病组、PNS组和他汀组空腹血糖较对

表2 干预后各组大鼠血脂、血清炎症因子、空腹血糖和体重比较

照组明显升高（均P＜0.01）。与糖尿病组比较，PNS组和他汀组血清 TG、TC、TNF-α、IL-1β 和 LDL-C 水平均降低（均P＜0.05），与PNS组比较，他汀组LDL-C降低更为明显（P＜0.01）。糖尿病组血清IL-13水平较对照组降低（P＜0.05），经PNS和他汀干预后IL-13表达均有所升高，但与糖尿病组相比无统计学差异。

2.2 各组大鼠主动脉冷冻切片油红染色结果 见图1。

图1 各组大鼠主动脉冷冻切片油红染色图

由图1可见，糖尿病组血管内膜及外膜脂质含量明显增加；PNS组和他汀组主动脉内膜及外膜的脂质含量均明显改善，他汀组主动脉脂质含量降低更为明显；对照组脂滴在主动脉血管上的表达最少。

2.3 各组大鼠主动脉TLR-4、SR-BI和 ABCA1 mRNA表达量比较 见图2。

由图2可见，糖尿病组大鼠主动脉组织的TLR-4 mRNA表达明显较对照组升高（P＜0.01）。与糖尿病组比较，他汀组TLR-4 mRNA表达明显降低（P＜0.01），SB-RImRNA和ABCA1mRNA表达明显上调（均P＜0.01）；与糖尿病组比较，PNS组TLR-4 mRNA表达降低，SBRI mRNA和ABCA1 mRNA水平升高，但未达统计学差异（均P＞0.05）。

图2 各组大鼠主动脉TLR-4、SR-BI和ABCA1 mRNA表达量比较（与糖尿病组比较，**P＜0.01）

2.4 各组大鼠主动脉TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表达比较 见图3。

图3 各组大鼠主动脉TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表达比较（与糖尿病组比较，**P＜0.01；与他汀组比较，▲P＜0.05）

由图3可见，与对照组比较，糖尿病组主动脉组织TLR-4蛋白明显升高（P＜0.01），SB-RI蛋白和ABCA1蛋白表达明显降低（均P＜0.01）。与糖尿病组比较，PNS组和他汀组TLR-4蛋白表达均明显降低（均P＜0.01），SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表达均明显升高（均P＜0.01）。而PNS组SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表达水平均低于他汀组（均P＜0.05）。

3 讨论

动脉粥样硬化是血脂代谢异常、高血糖和高血压等多因素作用下的慢性炎症性疾病，它的发生、发展过程与血管局部及全身的炎症反应可能存在密切的关系，而血管内皮细胞受损被认为是动脉粥样硬化病变的始动因子[1，4]。本研究发现糖尿病组高脂喂养的SD大鼠主动脉内膜和外膜脂质含量增加，血清炎症因子TNF-α和IL-1β表达增加，而抗炎因子IL-13表达降低，血管壁TLR-4基因和蛋白表达明显升高，而逆胆固醇脂转运的SR-BI和ABCA1在血管壁上表达降低。PNS和阿托伐他汀钙干预后血清炎症因子表达降低，主动脉血管壁SR-BI和ABCA1基因及蛋白表达上调。

炎症反应贯穿于动脉粥样硬化的整个过程，高脂、高血糖状态下，炎症反应更加剧烈[2，5]。本研究也观察到类似的结果，糖尿病组SD大鼠的血清炎症因子表达较对照组SD大鼠明显升高。这与他汀具有调脂作用外，尚有抗炎的作用相关[6]。动脉粥样硬化状态下往往TNF-α和IL-1β等促炎症因子表达增加，而抗炎因子如IL-13表达减少[7－8]。本研究中糖尿病组SD大鼠经他汀治疗后，除降低LDL外，明显降低血清炎症因子TNF-α和IL-1β表达，同时增加抗炎因子IL-13表达。既往的研究发现PNS具有抗炎、抗氧化的作用，改善不稳定心绞痛患者的血清炎症因子表达，改善冠心病心绞痛的临床症状[9-10]。我们发现PNS具有类似于阿托伐他汀钙降低TNF-α和IL-1β，以及升高IL-13水平的作用。然而，糖尿病组SD大鼠的体重明显低于对照组，可能与STZ所致的糖尿病类似于临床上的1型糖尿病，消瘦表现更为明显，而与腹型肥胖为特征的2型糖尿病不同。他汀与PNS均不能有效改善STZ所致糖尿病大鼠的血糖和体重，这可能与PNS对糖尿病动脉粥样硬化的干预作用不是通过调节血糖实现有关。

动脉粥样斑块中TLR-4表达明显增加，促进清道夫受体CD36表达增强，促使巨噬细胞摄入oxLDL，加速泡沫细胞的破裂和斑块的不稳定[11]。SR-BI是第一个在分子水平确定的HDL的天然膜受体,促进胆固醇向肝脏转运和代谢，具有抗动脉粥样硬化的作用[12]；而ABCA1表达增加促进游离胆固醇结合到乏酯的新生HDL上，起着胆固醇的逆转运作用，也具有改善动脉粥样硬化的作用[13]。大量的研究发现高脂血症和糖尿病明显降低ABCA1和SR-BI的基因表达，升高TLR-4的基因表达，而他汀类药物有降低TLR-4表达与升高SR-BI和ABCA1基因表达作用，本研究与既往的报道相类似[14-15]。PNS具有调整血脂代谢的作用[2]，但PNS干预组SD大鼠后，LDL-C降低不如他汀组明显，这可能与他汀具有更明显抑制胆固醇合成的作用有关。我们发现PNS与他汀具有类似的上调SR-BI和ABCA1基因表达和降低TLR-4基因表达，但与糖尿病组SD大鼠无统计学差异，而蛋白水平比较存在差异，可能是PNS加强TLR-4、SR-BI和ABCA1基因在转录后水平上的调节有关，但具体机制有待于后续的研究。PNS降低主动脉脂滴的沉着，可能是通过调节胆固醇转运蛋白的表达，进而影响血脂的代谢和改善粥样硬化的斑块进展。

总之，本研究发现PNS具有降低糖尿病高脂喂养SD大鼠的炎症因子表达，改善动脉粥样硬化的慢性炎症状态，减缓高脂血症、高血糖状态对动脉粥样斑块的进展。本研究为进一步阐述PNS在分子水平上对动脉粥样硬化的作用机制提供新的理论依据，也部分解释了PNS改善心绞痛症状和稳定斑块可能是通过改善脂质代谢和减轻炎症的作用有关。