青石止痒软膏的质量标准研究

姜颖娟 张丰川 蔡玲玲 孔宇虹 付蓉 胡博 聂晶 邓颖 李元文

摘要  目的：建立青石止痒软膏的质量控制标准。方法：对青石止痒软膏的原辅料进行质量标准检查，检查其装量、粒度及微生物限度;采用薄层色谱法对青石止痒软膏中青黛、苦参和黄柏进行鉴别;采用高效液相色谱法测定甘石青黛膏中靛蓝及靛玉红的含量，色谱柱为Waters Symmetry Shiled-RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-水（65：35）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长285 nm，柱温25 ℃。结果：青石止痒软膏的原辅料、3批甘石青黛膏装量、粒度及微生物限度均符合2010版《中华人民共和国药典》的有关规定;青石止痒软膏中青黛、苦参、黄柏的薄层色谱图斑点明显，阴性对照无干扰;靛蓝在2.35～4.7 μg（r=0.999 8）范围内，靛玉红在0.008 32～0.291 2 μg（r=0.999 6）范围内，与峰面积呈良好的线性关系。结论：本实验建立的方法快速简便，准确可靠，可作为该制剂的质量控制方法。

关键词  青石止痒软膏;青黛;苦参;黄柏;质量标准

Research on Quality Standards of Qingshi Zhiyang Ointment

Jiang Yingjuan 1，Zhang Fengchuan 1，Cai Lingling 1，Kong Yuhong 1，Fu Rong 1，Hu Bo 1，Nie Jing 2，Deng Ying 1，Li Yuanwen 1

（1 Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2 The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective： To establish the quality control standards of Qingshi Zhiyang Ointment. Methods： The quality standard was tested on the raw and supplementary material of Qingshi Zhiyang Ointment，including the amount of drug loading，particle size and microbial limit.Indigo Naturalis，Radix Sophorae Flavescentis and Cortex Phellodendri in Qingshi Zhiyang Ointment were detected by thin layer chromatography.The mobile phase was methanol-water （65：35），the detection wavelength was 285 nm，and the flow rate was 1.0 mL/min.The mobile phase consisted of Waters Symmetry Shiled-RP18 column （150 mm×4.6 mm，5 μm），and the column temperature was maintained at 25 ℃. Results： The raw materials of Qingshi Zhiyang Ointment，the batches of three batches of calcite，the particle size and the microbial limit were consistent with the relevant provisions of the 2010 edition of the Chinese Pharmacopoeia.The thin-layer chromatograms of Indigo Naturalis，Radix Sophorae Flavescentis and Cortex Phellodendri in Qingshi Zhizhi ointment were obvious，and the negative control had no interference.There was a good linear relationship between the concentration of indigo and indirubin，and the peak area of them were in the range of 2.35-4.7 μg （r=0.9998） and 0.00832-0.2912 μg （r=0.9996）. Conclusion： The method of this experiment is simple，accurate and reliable，which can be used as a quality control method of the preparation.

Key Words  Qingshi Zhiyang Ointment; Indigo Naturalis; Radix Sophorae Flavescentis; Cortex Phellodendri; Quality standards

中图分类号：R283.6 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2018.11.003

青石止痒软膏（原名甘石青黛膏）由青黛、煅炉甘石、煅石膏、苦参、关黄柏、冰片組成，具有清热解毒，除湿止痒的功效，临床用于治疗神经性皮炎及湿疹，以其显著的疗效、良好的安全性、较少的复发率沿用至今，近年来我科对其进行了大量的实验研究及临床研究 [1-5]，在药物组成、基质以及制备工艺等方面不断进行改良。为保证临床疗效和合理安全用药，故按照2010版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》） [6]各项规定对青石止痒软膏的原辅料进行质量标准检查，建立处方中各药材在复方制剂中的薄层鉴别方法，采用高效液相色谱法建立处方中靛蓝及靛玉红含量的测定方法，以期为该制剂的临床安全用药提供实验依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 卧式转筛粉碎机WZS3-470（山东省烟台市芝罘制药机械厂）;电子分析天平AG135（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;超声波清洗器KQ-250B（昆山市超声仪器有限公司）;电热恒温水浴锅HH﹒S21-Hi4（北京市长源实验设备厂）;电子天平JJ200（常熟市双杰测试仪器厂）;电热鼓风干燥箱DGG102-0SB（天津天宇机电有限公司）;薄层色谱硅胶G预制板（青岛海洋化工厂分厂）;1100型高效液相色谱仪（UV检测器，美国Aglient公司）;AE-240型电子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 试剂 靛玉红对照品（110717-200204）购自中国食品药品检定研究院;盐酸小檗碱对照品（110713-201212）购自中国食品药品检定研究院;苦参对照药材（121019-200304）购自中国食品药品检定研究院;靛蓝对照品（中国食品药品检定研究院，批号110716-200509）;靛玉红对照品（中国食品药品检定研究院，批号717-200204）;青石止痒软膏由北京中医药大学东方医院制剂室制备;甲醇、乙醇、三氯甲烷、甲苯、丙酮、异丙醇、浓氨水、碘化铋钾、十四烷酸异丙酯、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、肉汤培养基、胆盐乳糖培养基等。

2 方法与结果

2.1 原辅料的质量标准研究

2.1.1 青黛 本品为为爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.、蓼科植物蓼蓝Polygonum tinctorium Ait.或十字花科植物菘蓝Isatis indingotica Fort.的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末、团块或颗粒。主要产地：福建、江苏、云南、安徽等。符合《中国药典》2010年版一部第185页青黛项下的各项规定，购于北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，批号为300002729。

2.1.2 煅炉甘石 本品为碳酸盐类矿物方解石族菱锌矿，主含碳酸锌（ZnCO3）。主要产地：湖南、四川、广西、云南等。符合《中国药典》2010年版一部第211页煅炉甘石项下的各项规定，购于北京圣惠堂中药饮片有限公司，批号为13072503。

2.1.3 煅石膏 本品为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏，主含含水硫酸钙（CaSO4·2H2O）。主要产地：湖北、河南、安徽、四川、湖南、山东等。符合《中国药典》2010年版一部第88页煅石膏项下的各项规定，购于北京仟草中药饮片有限公司，批号为120404012。

2.1.4 苦参 本品为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根。主要产地：山西、河南、河北、湖北等。符合《中国药典》2010年版一部第188页苦参项下的各项规定，购于北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，批号为301003666。

2.1.5 关黄柏 本品为芸香科植物黄檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥树皮。主要产地：辽宁、吉林、河北、黑龙江等。符合《中国药典》2010年版一部第137页关黄柏项下的各项规定，购于北京圣惠堂中药饮片有限公司，批号为13061003。

2.1.6 冰片 本品为化学合成品。符合《中国药典》2010年版一部第136页冰片项下的各项规定，购于北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，批号为300002106。

2.1.7 特级初榨橄榄油 本品经上海市质量监督检验技术研究院检验为合格产品。

2.1.8 蜂蜡 本品符合GH013-82项下的有关规定。

2.2 药品成品的质量标准研究

2.2.1 名称 青石止痒软膏Ganshi Qingdai Gao。

2.2.2 处方 青黛20 g、煅炉甘石60 g、煅石膏30 g、关黄柏30 g、苦参30 g、冰片10 g。

2.2.3 制法 以上六味，将青黛、段炉甘石、煅石膏、苦参、关黄柏粉碎成细粉，过100目筛，混匀;将冰片研细，与上述细粉配研混匀，另取橄榄油745.5 g加入蜂蜡74.5 g，加热使熔化，待冷至40～50 ℃时，加入上述细粉，搅匀，分装，辐射灭菌即得。

2.2.4 性状 根据3批样品（批号20140701、20140702、20140703）的实际性状描述。本品为蓝灰色的软膏，气清香。

2.2.5 薄层色谱鉴别

鉴别方法均参照《中国药典》（2010年版）一部（附录Ⅵ B）照薄层色谱法试验，对青石止痒软膏中青黛、黄柏以及苦參的提取方法、展开系统、比例、点样量、等影响薄层鉴别因素进行考察，最终确定青石止痒软膏中青黛、黄柏及苦参的薄层鉴别方法。

2.2.5.1 青黛薄层色谱鉴别 供试品溶液制备：取本品10 g，加硅藻土5～6 g拌匀，加95%乙醇30 mL，超声处理30 min，静置过夜，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。缺青黛阴性溶液制备：取缺青黛的软膏样品，同法制成缺青黛阴性溶液。对照品溶液制备：取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。鉴别方法：吸取对照品溶液5 μL，供试品溶液6 μL，空白对照溶液各6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶ 4∶ 1）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的浅紫红色斑点，空白对照无干扰。见图1。

2.2.5.2 关黄柏薄层色谱鉴别 供试品溶液制备：同2.2.5.1项下供试品溶液制备方法。缺关黄柏阴性溶液制备：取缺关黄柏的软膏样品，同法制成缺关黄柏阴性溶液。对照品溶液制备：取盐酸小檗碱对照品，加无水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。鉴别方法：分别吸取上述溶液各0.5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液（12∶ 6∶ 3∶ 3∶ 1）为展开剂，置氨蒸气饱和的缸内展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点，空白对照无干扰。见图2。

图1 青黛薄层色谱鉴别    注：1.青石止痒软膏供试品①;2.青石止痒软膏供试品②;3.青石止痒软膏供试品③;4.靛玉红对照品;5.青黛阴性对照

图2 关黄柏薄层色谱鉴别    注：1.青石止痒软膏供试品①;2.青石止痒软膏供试品②;3.青石止痒软膏供试品③;4.盐酸小檗碱对照品;5.黄柏阴性对照

2.2.5.3 苦参的薄层鉴别 供试品溶液制备：同2.2.5.1项下供试品溶液制备方法。缺苦参阴性溶液制备：取缺苦参的软膏样品，同法制成缺苦参阴性溶液。对照药材溶液制备：苦参对照药材0.2 g，加三氯甲烷20 mL，浓氨水0.4 mL，超声处理30 min，过滤，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。鉴别方法：吸取对照药材溶液4 μL，供试品溶液和空白对照溶液各6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8∶ 3∶ 0.5）为展开剂，置氨蒸气饱和的缸内展开，展距12 cm，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙色斑点，空白对照无干扰。见图3。

图3 苦参的薄层鉴别    注：1.青石止痒软膏供试品①;2.青石止痒软膏供试品②;3.青石止痒软膏供试品③;4苦参对照药材;5.苦参阴性对照

2.2.6 检查

2.2.6.1 装量 本品的标示装量为10 g。按照《中国药典》2010年版一部附录IR软膏剂项下的有关规定，对三批样品进行了检查，平均装量应不少于标示装量，每个容器装量不少于标示装量的93%，均符合规定。见表1。

2.2.6.2 粒度 取适量软膏涂成薄层，薄层面积相当于盖玻片面积，共涂3片，参照《中国药典》二部附录ⅨE粒度和粒度分布测定法测定，未检出大于180 μm的粒子。

2.2.6.3 微生物限度 取本品10 g，加无菌十四烷酸异丙酯20 mL，振摇至供试品分散均匀，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，振摇、静置待油水分层，取水层作为1∶ 10的供试液;取1∶ 10的供试液1 mL，置pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL中，即为1∶ 100的供试液，同法10倍系列稀释至1∶ 1 000的供试液。细菌计数：取1∶ 10的供试液1 mL，等量分注于5个平皿中，每皿0.2 mL;霉菌和酵母菌计数：取1∶ 10的供试液1 mL，注皿;金黄色葡萄球菌检查：取1∶ 10的供试液10 mL，置营养肉汤培养基100 mL中;铜绿假单胞菌检查：取1∶ 10的供试液10 mL，置胆盐乳糖培养基100 mL中;以上均参照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC进行检查。1 g供试品中，细菌数不得过10 000 cfu，霉菌和酵母菌数不得过100 cfu，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均不得检出。按照上述确定的标准检验供试品，结果符合规定。见表2。

2.2.7 含量测定

青黛为本方的君药，主要含有靛蓝及靛玉红，故选择靛蓝及靛玉红作为控制本品质量的指标成分。参照2010版《中国药典》一部，建立高效液相色谱法测定本品中靛蓝及靛玉红含量的方法。

2.2.7.1 色谱条件 采用Waters Symmetry Shiled-RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-水（65∶ 35）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长285 nm，柱温25 ℃。

2.2.7.2 对照品溶液的制备 称取经五氧化二磷干燥至恒重的靛蓝与靛玉红对照品适量，分别加入甲醇-三氯甲烷（8∶ 2，V/V）制成每1 mL含靛蓝235 μg与靛玉红2.08 μg的混合溶液，摇匀，即得。

2.2.7.3 供试品溶液的制备 精密称取样品1.0 g，加入甲醇-三氯甲烷（8∶ 2，V/V）50 mL，经超声处理30 min，超声功率为140 W，频率为40 kHz，放至室温，补重。于冰箱（-4 ℃）放置2 h后迅速滤过，取续滤液25 mL蒸干，残渣加甲醇-三氯甲烷（8∶ 2，V/V）使溶解并转移至5 mL棕色量瓶中，加甲醇-三氯甲烷（8∶ 2，V/V）稀释。

2.2.7.4 阴性样品溶液的制备 按处方比例制备不含青黛的软膏样品，按“2.2.7.3”項下方法制备阴性样品溶液。

2.2.7.5 专属性试验 在“2.2.7.1”项下的色谱条件下，对照品、样品及阴性样品的液相色谱图结果显示，样品中其他成分对靛蓝与靛玉红的测定无干扰。见图4。

2.2.7.6 线性关系考察 分别精密吸取靛玉红标准品4、6、8、10、12、14 μL及靛蓝对照品溶液10、12、14、16、18、20 μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得靛玉红回归方程为Y=6 958.8X-26.769，r=0.999 6（ n =6），靛蓝回归方程为Y=41.581X-6.238 1，r=0.999 8（ n =6）。结果表明，靛蓝进样量在2.35～4.7 μg范围内，靛玉红进样量在0.008 32～0.291 2 μg范围内，进样量与峰面积内线性关系良好。

2.2.7.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积。结果表明，靛玉红的 RSD 为1.5%，靛蓝的 RSD 为1.3%，符合精密度要求，表明仪器精密度良好。见表3。

2.2.7.7 重复性试验 精密称定样品6份，分别按“2.2.7.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.7.1”项下色谱条件进样10 μL，测定峰面积，计算 RSD 。靛蓝重复性试验的 RSD 为2.5%，靛玉红的 RSD 为2.9%，表明该方法重复性良好。见表4。

2.2.7.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，进样10 μL，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h注入高效液相色谱仪。测得靛蓝峰面积的 RSD 为1.6%，靛玉红峰面积的 RSD 为1.3%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。见表5。

2.2.7.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同批样品0.5 g共6份，精密加入靛蓝对照品溶液各6.0 mL与靛玉红对照品溶液各5.0 mL，分别按“2.2.7.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.7.1”项下色谱条件进样10 μL，计算得到靛蓝与靛玉红的平均回收率分别为95.4%与96.7%， RSD 分别为2.3%与2.6%。见表6。

2.2.7.10 样品测定 取不同批次样品5份，分别按“2.2.7.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.7.1”项下色谱条件进样10 μL，以外标法计算得到其中靛蓝的含量为2.964 mg/g， RSD 为2.3%，靛玉红的含量为21.39 μg/g， RSD 为2.1%。见表7。

3 讨论

青石止痒软膏由青黛、煅炉甘石、煅石膏、苦参、关黄柏、冰片组成，方中青黛性咸寒，归肝、肺、胃经，具有清热凉血，泻火解毒的功效，为本方之君药，现代药理研究其角叉菜胶致大鼠足肿胀及大鼠棉球肉芽肿有较强的抑制作用，说明青黛有较显著的抗炎、镇痛作用 [7];煅炉甘石性甘、平、温，归肝、脾、肺经，敛疮收湿止痒，为本方之臣药，其可促进肉芽组织中的新生毛细血管生成，促进成纤维细胞增殖，加快创面肉芽组织增生，进而加快创面的愈合 [8];苦参、黄柏性苦寒，二者清热解毒，燥湿杀虫，可通过稳定细胞膜抑制肥大细胞释放组胺和直接竞争组胺H1受体产生抗炎作用 [9]。盐酸小檗碱对小鼠迟发型超敏反应以及IgM的生成具有明显的抑制作用 [10];冰片性辛、苦、凉，取效散郁火、消肿痛，具有抗细菌、真菌、消炎镇痛等药理作用 [11]。基质蜂蜡性甘、微温，收涩敛疮、润肤生肌;橄榄油收敛润肤;全方共奏清热解毒、收湿敛疮、润肤止痒之功效。

青石止痒软膏中原料青黛、煅炉甘石、煅石膏、苦参、黄柏、冰片均符合《中国药典》2010年版各药项下的各项规定，辅料橄榄油及蜂蜡均符合有关规定，在成品的治疗标准中主要对三批样品的性状、检查（包括装量、粒度、微生物限度）、鉴别各项进行研究;建立了以靛玉红、盐酸小檗碱等为对照品的青黛、黄柏等药材在复方制剂中的薄层鉴别方法，青石止痒软膏中青黛、苦参、黄柏的薄层色谱图斑点明显，阴性对照无干扰;采用高效液相色谱法测定青石止痒软膏中靛蓝及靛玉红的含量，靛蓝在2.35～4.7 μg（r=0.999 8）范围内，靛玉红在0.008 32～0.291 2 μg（r=0.999 6）范围内，与峰面积呈良好的线性关系。本实验建立的方法快速简便，准确可靠，可作为该制剂的质量控制方法，最终确立了较完善的青石止痒软膏质量标准草案。

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