氧化还原响应的普鲁兰纳米药物载体研究

穆晓玲

摘要 采用透析法制备PSA和PSSSA自组装纳米粒。用动态激光光散射（DLS）测得PSA和PSSSA的粒径分别为189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm。体外细胞毒性和溶血性试验结果表明，PSA和PSSSA载体在高浓度PSA（500 μg/ml）和PSSSA（500 μg/ml）下均无细胞毒性，且均具有良好的生物相容性。

关键词 普鲁兰；药物载体系统

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2018）02-019-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.02.009

普鲁兰多糖（pullulan）是1938年由R.Bauer发现的一种特殊的微生物多糖[1]，是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖普鲁兰多糖，具有无毒、水溶性好以及表面易于修饰等特点，目前正被逐渐应用于纳米药物载体的研究中。然而对普鲁兰进行疏水化修饰制备纳米药物载体的研究很少，且与形成的载药纳米粒的毒性、细胞摄取和体内生物效应相关的研究也很少[2]。

鉴此，文中采用透析法制备PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒[3]，合成还原敏感的经硬脂酸疏水改性的普鲁兰多糖，使其在水溶液中能够自组装形成纳米粒子，并结合纳米粒子体外细胞毒性试验综合评估其作为药物载体的效果。

1 材料和方法

1.1 PSSSA和PSA自组装水凝胶纳米粒的制备

采用透析法制备PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒：分别准确称取10 mg PSSSA和PSA样品溶于2 ml的DMSO中，然后转移至透析袋（MWCO6000-8000），放置于1 L的超纯水中透析48 h，前12 h每3 h换水1次，后36 h每隔8 h换水1次，将DMSO熔剂彻底透析干净后，取出溶液，50 W超声波清洗2 min，于10 ml容量瓶中定容。用0.45 μm滤膜过滤即得到PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒。

1.2 PSA和PSSSA粒径、Zeta电位、临界胶束浓度（CMC）的测定

PSA和PSSSA自组装纳米粒的粒径、Zeta电位和多分散指数（PDI）根据动态光散射原理（DLS），在室温条件下用1 mg/ml浓度的PSA和PSSSA自组装纳米水凝胶通过纳米粒度与Zeta电位分析仪测得，每个样品测3次。采用稳态荧光探针法来测量PSA和PSSSA的CMC。

1.3 PSA/DOX和PSSSA载药纳米粒的体外细胞试验

1.3.1 MTT法检测PSA和PSSSA载药纳米粒的细胞毒性 将指数生长期的COS-7细胞用细胞胰酶消化，调节细胞浓度为5×104个/ml，以200 μl/孔接种于96孔板，37℃，5% CO2培养24 h后加入一定濃度梯度的空白纳米粒或载药纳米粒悬液于培基中，37℃，5% CO2培养48 h，弃掉培养液，每孔加100 μl MTT溶液（终浓度为0.5 mg/ml）于5%CO2，37℃培养4 h。小心吸去培养液并加入DMSO（100 μl/孔）溶解蓝紫色的甲瓒，震荡2 min待结晶充分溶解后用酶标仪测定570 nm的OD值，参考波长为630 nm，分别设计正常对照和空白对照（不加药物为正常对照组，空白培养基为空白组），每个样品平行测定3次，计算细胞存活率。公式为：

细胞存活率（%）=（OD损伤孔-OD损伤孔空白）/（OD对照孔-OD对照孔空白）×100%。

1.3.2 细胞溶血性试验 取健康新西兰大白兔新鲜血液8 ml，加入肝素抗凝，加入10 ml 0.9%生理盐水稀释，向1 ml的不同浓度PSSSA和PSA中加入100 μl稀释血液，于37℃中温育12 h，750 rpm离心5 min，加入2 ml乙醇/盐酸，再750 rpm离心5 min，测其在398 nm处的吸光值。阴性对照为0.9%生理盐水，阳性对照为水。公式为：

溶血率（%）=（OD样品-OD阴性）/（OD阳性-OD阴性）×100%

2 结果与分析

2.1 PSA和PSSSA自组装纳米粒的基本性质

从表1可以看出，透析法制备的PSA和PSSSA自组装纳米粒在超纯水中的平均粒径分别为189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm，Zeta电位分别为-12.9±0.3 mV和-10.4±0.4mV。结合作图（图1）计算得出PSA在胶束浓度 98.5 μg/ml以上时成球，PssSA在胶束浓度 133.35 μg/ml以上时成球，即可形成自组装纳米粒。可见，PSA的粒径和CMC小于PSSSA，但其Zata电位大于PSSSA，这可能是由于PSSSA中加入了二硫键，使其电位降低。

2.2 PSSSA/DOX和PSSSA/DOX载药纳米粒的体外细胞试验结果

2.2.1 细胞毒性能 利用COS-7细胞作为正常细胞组进行空白纳米粒的毒性试验，以便对载体的安全性能进行评估。从图2可以看出，PSA与PSSSA在浓度达到500 μg/μl时，COS-7细胞的存活率均在90%以上，说明空白纳米粒对COS-7细胞基本无毒，即PSA和PSSSA载体均具有良的生物相容性。同时还能看出随着空白纳米粒浓度的升高，细胞毒性逐渐加大。

2.2.2 细胞溶血性 利用新西兰大白兔新鲜血液作为正常细胞组进行空白纳米粒的溶血性试验，从表2可以看出，随着PSA空白纳米粒浓度的增加，溶血率没有出现特别明显的趋势变化；而随着PSSSA空白纳米粒浓度的增加，溶血率逐渐增加。

3 结论

（1）采用透析法制备经硬脂酸修饰的普鲁兰多糖（Pullulan）衍生物PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒，粒径大小分别为189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm。经稳态荧光探针法测得PSA和PSSSA临界胶束浓度分别为0.0 985 mg/ml和0.13 335 mg/ml。表明PSA和PSSSA衍生物在水溶液中均能够自组装形成水凝胶纳米粒。

（2）MTT法测定的细胞毒性试验结果显示，当空白纳米粒的浓度高达500 μg/μl时，COS-7细胞在48 h后存活率依然在90%以上；溶血性试验中，PSA和PSSSA浓度达到1 mg/ml时，溶血率依然在5%左右，表明PSA和PSSSA载体均基本无毒，生物相容性较好。

参考文献

[1] 王浩，张晓军，沈佳佳，等. 一种新型的胞外多糖——普鲁兰[J]. 中国食品添加剂，2005（6）：60-63.

[2] 崔双. 生育酚改性普鲁兰自组装纳米胶束用于抗癌药物的传递[D].大连：大连理工大学，2013.

[3] 蒋丽琴. 胆固醇基普鲁兰自组装纳米粒与肝癌细胞相互作用的研究[D].北京：北京协和医学院中国医学科学院；北京协和医学院；中国医学科学院；清华大学医学部，2013.

责任编辑：刘赟