田蓟苷对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织的保护作用研究

马丽月 曾诚 郑瑞芳 姜雯 何承辉 邢建国

中圖分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）20-2805-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.15

摘 要 目的：研究田蓟苷（TIL）对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织的保护作用。方法：120只雄性SD大鼠随机分为假手术组（0.9%氯化钠溶液）、模型组（0.9%氯化钠溶液）、尼莫地平组（32 mg/kg）和TIL低、中、高剂量组（4、8、16 mg/kg），每组20只。灌胃相应药物，每天1次，连续7 d，末次给药15 min后，以改良线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型。进行大鼠神经功能缺损评分；计算大鼠脑梗死体积百分比；采用苏木精-伊红染色法观察大鼠脑组织病理形态学；检测大鼠脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、乳酸脱氢酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量；采用Western blot法检测大鼠脑组织中降钙素基因相关肽（CGRP）、血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）蛋白表达。结果：与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高（P<0.01）；脑组织梗死体积百分比显著升高（P<0.01）；脑组织神经细胞明显缩小变形，细胞间质水肿明显；脑组织中SOD、CAT活性均显著减弱，LDH活性显著增强，MDA含量显著增加，CGRP、VEGFR2蛋白表达均显著增强（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，尼莫地平组和TIL中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分均显著降低（P<0.05或P<0.01）；脑组织梗死体积百分比均显著降低（P<0.05或P<0.01）；脑组织上述病理改变均明显减轻；脑组织中SOD、CAT活性均显著增强，LDH活性均显著减弱，MDA含量均显著减少，CGRP、VEGFR2蛋白表达均显著增强（P<0.05或P<0.01）。结论：TIL对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织具有一定保护作用，其机制可能与上调CGRP和VEGFR2表达有关。

关键词 田蓟苷；脑缺血再灌注损伤；降钙素基因相关肽；血管内皮细胞生长因子受体2；保护作用

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of tilianin（TIL） on brain tissue in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. METHODS： Totally 120 male SD rats were randomly divided into sham operation group （0.9% sodium chloride solution）， model group （0.9% sodium chloride solution）， nimodipine group （32 mg/kg） and TIL low-dose and medium-dose， high-dose groups （4， 8， 16 mg/kg）， with 20 rats in each group. The rats were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. 15 min after last medication， cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by reforming suture-occluded method. The neurological deficit score in rats were evaluated， and percentage of cerebral infarction volume of rats was determined. Histopathological changes of brain tissue were observed by HE staining. The activities of SOD， CAT and LDH， MDA content in cerebral tissue of rats were determined. The expression of calcitonin gene-related peptide （CGRP） and peripheral vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2） protein were determined by Western blot assay. RESULTS： Compared with sham operation group， neurological deficit score and percentage of cerebral infarction volume of model group were increased significantly （P<0.01）； the nerve cells in brain tissue were significantly reduced and the interstitial edema was obvious. SOD and CAT activities were decreased significantly， LDH activity was increased significantly， MDA content was decreased significantly，protein expression of CGRP and VEGFR2 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， neurological deficit score of nimodipine group， TIL medium-dose and high-dose groups were decreased significantly； percentage of cerebral infarction volume was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； above pathological conditions of cerebral tissue in rats were relieved significantly； SOD and CAT activities were strengthened significantly， MDA content and LDH activities were decreased significantly， protein expression of CGRP and VEGFR2 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TIL has certain protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， and its mechanism may be related to the up-regulation of CGRP and VEGFR2 expression.

KEYWORDS Tilianin； Cerebral ischemia-reperfusion injury； CGRP； VEGFR2； Protection

田蓟苷（Tilianin，TIL）是新疆维吾尔药香青兰（Dracocephalum moldavica L.）的主要活性成分，属黄酮类化合物[1]。研究表明，TIL对模型大鼠高血压、高血脂、动脉粥样硬化等病理状态均有显著改善作用，并对模型大鼠心肌缺血再灌注损伤有显著保护作用[2-4]，在心脑血管疾病的防治方面具有广阔的应用前景。

脑缺血再灌注损伤是脑卒中溶栓并发症之一，是指脑组织经过一定时间的缺血缺氧，待血液供应恢复后，过量的自由基攻击该部分重新获得血液供应的脑组织内的细胞造成的损伤[5]。其过程是一个快速的级联反应，包括诸多环节，如炎性细胞浸润、能量代谢障碍、细胞凋亡、细胞水肿、自由基生成等[6-7]。

本实验通过建立脑缺血再灌注损伤模型，考察不同剂量的TIL对模型大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、脑组织病理形态学、脑组织中相关实验指标及降钙素基因相关肽（CGRP）和血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）蛋白表达的影响，从促进血管新生的角度探讨TIL在模型大鼠脑缺血再灌注损伤过程中发挥的作用，为其进一步研究与应用奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

FluorChem HD2型化学发光凝胶成像系统（美国Alpha Innotech公司）；Mini-protean 3型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）仪（美国Bio-Rad公司）；BS210S型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；Microfuge 22R型台式微量冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；HP Scanjet F2410型扫描仪（美国HP公司）；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SG-200型塑料薄膜封口机（上海凯鸣电子机械有限公司）；620E型冰冻切片机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；CHK213型光学显微镜（日本Olympus公司）；HY-2A型水浴恒温振荡器（金坛市医疗仪器厂）；UV-2501PC型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；BCD-206STPA型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；Image Pro Plus 6图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

1.2 药品与试剂

TIL（新疆维吾尔自治区药物研究所自制，批号：20170805，纯度：95%）；尼莫地平（黑龙江天宏药业股份有限公司，批号：20160823，规格：60 mg/片）；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量试剂盒（批号：P1511）、放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解缓冲液（批号：P0013B）；5×蛋白上样缓冲液均购自北京普利莱基因技术有限公司；苏木精-伊红（HE）染色液（北京博奥森生物技术有限公司，批号：170609）；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（批号：20171205）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（批号：20171127）、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（批号：20171105）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（批号：20171211）均购自南京建成生物工程研究所；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：STY102）；CGRP一抗（批号：ab47027）、VEGFR2一抗（批号：ab461）均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；β-actin一抗（批号：TA-09）、山羊抗兔二抗（批号：ZB-23011）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；电化学发光法（ECL）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0018）；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，雄性，体质量220～260 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0036。所有大鼠实验期间自由进食饮水。

2 方法

2.1 分组与给药

将120只大鼠随机分成6组，即假手术组（等体积0.9%氯化钠溶液）、模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）、尼莫地平组（32 mg/kg）[8]和TIL低、中、高剂量组（4、8、16 mg/kg）[9]，每组20只。各组大鼠均灌胃相应药物，每天1次，连续7 d，灌胃体积为1 mL/100 g。

2.2 造模

采用改良线栓法[10]并略加改进以建立大脑中动脉阻断（MCAO）模型。末次给药15 min后，模型組、尼莫地平组和TIL低、中、高剂量组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/kg）进行麻醉，仰卧位固定于鼠板上，颈部正中切口，钝性分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。永久性结扎ECA和CCA的近心端，动脉夹临时夹闭ICA，CCA远心端结扎一道缝合线，勿扎紧。CCA接近ECA和ICA分叉处用眼科剪作一斜行细切口，插入顶端涂有硅胶的线栓，稍扎紧缝合线，松开动脉夹，推动线栓进入ICA，插入约0.8 cm时注意调整线栓方向，避免误入翼腭动脉，插入约1.8 cm时减慢插线速度，遇轻微阻力时即停止插线，此时MCAO 模型建立。记录栓塞开始时间，缝合肌肉、皮肤，栓塞30 min后拔出线栓。假手术组大鼠除不插入线栓外，其余操作与各组相同。

2.3 大鼠神经功能缺损评分

大鼠清醒后进行第1次神经功能缺损评分，以评价模型是否建立成功，评价标准参考相关文献[8，11]，总分共21分。以>7～<13分为模型建立成功；剔除<7分或>13分者，并随机补充各组设计所需的大鼠数量。本实验建模成功率为50.73%。大鼠给药7 d后，进行第2次神经功能缺损评分。神经功能缺损评分细则见表1。

2.4 大鼠脑梗死体积百分比的计算

造模成功24 h后，大鼠腹腔注射1%水合氯醛（0.35 mL/kg）进行麻醉，而后处死，剥离脑组织，置于-20 ℃冰箱内急冻5 min后取出，放入脑槽中沿冠状面水平切7刀，取中间6片，每片厚约2 mm。将切片放入2%TTC染色液中，严格避光，置于37 ℃水浴箱中，每隔10 min摇动1次，30 min后取出。正常脑组织呈红色，梗死组织呈白色。将脑组织切片置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后取出，用图像分析系统计算大鼠脑组织的梗死体积、总体积并计算大鼠脑梗死体积百分比[11-12]（大鼠脑梗死体积百分比=脑组织切片总梗死体积/脑组织切片总体积×100%）。

2.5 大鼠脑组织病理形态学的观察

造模成功24 h后，按“2.4”项下方法取脑组织，以10%中性甲醛溶液固定24 h后依次经水洗、脱水、透明、包埋。由切片机连续切取6 μm的冠状脑组织切片，经脱蜡、水化、染色（HE）、脱水、封片后，置于光学显微镜下随机选取5個视野观察大鼠脑组织病理形态学。

2.6 大鼠脑组织中SOD、CAT、LDH活性和MDA含量的检测

造模成功24 h后，按“2.4”项下方法取脑组织，于冰上剪碎后加入适量冷RIPA裂解缓冲液后研磨匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书，以紫外-可见分光光度计检测大鼠脑组织中SOD、CAT、LDH活性和MDA含量。

2.7 大鼠脑组织中CGRP和VEGFR2蛋白表达的检测

采用Wester blot法检测CGRP和VEGFR2蛋白表达。造模成功24 h后，按“2.4”项下方法取脑组织，分离右侧脑皮质，于冰上充分剥离白色梗死组织周边的组织，放入标识好的离心管中。加入RIPA裂解缓冲液（脑组织质量与裂解液体积比为1 ∶ 7），匀浆，超声（功率：250 W，频率：50 kHz，下同）处理5 s，静置5 s ，再超声处理1 min后以12 000 r/min离心30 min。取上清液，加入5×蛋白上样缓冲液以体积比1 ∶ 4稀释，95 ℃变性10 min，电泳，转膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h。加入一抗（CGRP：1 ∶ 1 000；VEGFR2：1 ∶ 500；β-actin：1∶ 1 000），4 ℃放置过夜，加入山羊抗兔二抗（1 ∶ 1 000），室温放置2 h。以ECL法显色，化学发光凝胶成像系统曝光，拍照。以目的条带与内参β-actin灰度值的比值表示蛋白表达强弱，进行半定量分析。

2.8 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行数据统计分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，尼莫地平组和TIL中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见表2。

3.2 各组大鼠脑梗死体积百分比比较

与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积百分比显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，尼莫地平组和TIL中、高剂量组大鼠脑梗死体积百分比均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见表3。

3.3 各组大鼠脑组织病理形态学比较

假手术组大鼠脑组织形态结构正常，可见神经细胞数量多，胞质丰富，细胞核大而圆，未见病理性损伤。模型组大鼠脑组织神经细胞明显缩小变形，细胞核固缩深染，核固缩呈三角形或不规则形状，部分胞核和胞质界限不清；细胞间质水肿明显，组织结构被破坏（疏松呈网状），染色浅淡，甚至在部分红染区域仅见到无明显结构的坏死组织。TIL低剂量组大鼠脑组织神经细胞排列紊乱无序，细胞核形态较模糊，有部分细胞体积变小，出现皱缩，部分细胞变性、坏死，细胞间质较疏松。尼莫地平组和TIL中、高剂量组大鼠脑组织病理改变均明显减轻，细胞排列较整齐，细胞形态较正常，细胞层数略少，细胞核清晰，细胞质较饱满，仅可见少量不同程度被破坏的细胞，详见图1。

3.4 各组大鼠脑组织中SOD、CAT、LDH活性和MDA含量比较

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中SOD、CAT活性均显著减弱，LDH活性显著增强，MDA含量显著增加，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，尼莫地平组和TIL中、高剂量组大鼠脑组织中SOD、CAT活性均显著增强，LDH活性均显著减弱，MDA含量均显著减少，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见表4。

3.5 各组大鼠脑组织中CGRP和VEGFR2蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中CGRP、VEGFR2蛋白表达均显著增强，差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，尼莫地平组和TIL中、高剂量组大鼠脑组织中CGRP、VEGFR2蛋白表达均显著增强，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见图2、图3。

4 讨论

脑缺血再灌注损伤模型动物脑部血液再灌注后，相关细胞损害和形态学改变程度较再灌注前更加明显[13-15]。本研究结果显示，8、16 mg/kg的TIL可有效改善模型大鼠脑组织病理形态学。

神经功能缺损评分是评价大鼠神经功能的指标，分值越低表明其神经功能越好。本研究结果显示，8、16 mg/kg的TIL可显著降低模型大鼠神经功能缺损评分，表明TIL有助于大鼠神经功能恢复。脑梗死体积百分比直观地反映了大鼠的梗死灶大小。本研究结果显示，8、16 mg/kg的TIL可显著降低模型大鼠脑梗死体积百分比，表明TIL有助于脑缺血后的康复。LDH是一种糖酵解酶，当组织细胞受损时，LDH活性会显著增强，这使得LDH成为评价组织损伤程度的有效指标[13]。本研究结果显示，8、16 mg/kg的TIL可显著减弱模型大鼠脑组织中LDH的活性，表明TIL可以减轻脑组织损伤。CAT为一种过氧化氢分解酶，可保护细胞免受H2O2的伤害[13]。本研究结果显示，8、16 mg/kg的TIL可显著增强模型大鼠脑组织中CAT的活性，避免脑组织损伤。SOD是机体内氧自由基的头号“杀手”，能将机体中有害的超氧阴离子自由基转化为过氧化氢，进而在其他酶的作用下转化成水和氧气[14]。生物膜被攻击引发脂质过氧化反应，会产生大量脂质过氧化物，MDA是其中最典型的产物之一，其含量通常可作为机体脂质过氧化反应程度的一个指标，也能间接反映机体的受损程度[14]。MDA的含量检测和SOD的活性检测通常同时进行，以便更好地评估组织的脂质过氧化损伤程度。本研究结果显示，8、16 mg/kg的TIL可显著增强模型大鼠脑组织中SOD的活性，减少MDA的含量，提示TIL具有抗氧化的脑保护作用。

目前研究表明，CGRP是一种广泛分布于中枢和外周神经系统中的辣椒素敏感感觉神经的重要肽类递质，具有增加脑血流量和神经保护双重功能，可促进血管生成[16-18]。同时，促进血管新生最主要的体液因子为血管内皮细胞生长因子（VEGF），其在体外可促进内皮细胞增生，在体内可诱导血管生成，同时还可促进单核细胞、中性粒细胞的迁移，并参与脑缺血性损伤的炎症反应[19]。VEGF受体主要包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3等，其中VEGFR2是血管内皮细胞上的主要受体类型，是血管形成的主要调控因子，与血管形成和生长密切相关[20]。因此，推测CGRP和VEGFR2可能在血管新生的早期发挥关键性作用，是整个脑缺血后血管新生调控的中心环节。大鼠脑缺血再灌注损伤发生时，机体产生应激性反应，CGRP和VEGFR2蛋白表达均增强，但这种自我修复能力有限，不足以改善脑缺血预后。本研究结果显示，8、16 mg/kg的TIL可顯著增强模型大鼠脑组织中CGRP和VEGFR2蛋白表达，说明TIL具有促进内源性血管新生的作用。

综上所述，TIL对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织具有一定保护作用，其机制可能与上调CGRP和VEGFR2表达有关。

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（收稿日期：2018-01-08 修回日期：2018-03-06）

（编辑：张 静）