安徽省西瓜枯萎病菌遗传多样性ISSR—PCR分析

李萍　刘冬　姜晓斌　余碧霞

摘 要：以42株来自安徽省不同地区的西瓜枯萎病菌为试材，采用Inter-simple Sequence Repeats（ISSR）技术对其群体的遗传多样性进行分析，探究病菌的遗传分化与地理来源之间的相关性.结果表明，用筛选出的11个随机引物对西瓜枯萎病菌菌株进行ISSR-PCR扩增，共获得129个ISSR条带，其中多态性条带为94个，占72.9%，表明安徽省西瓜枯萎病菌存在较丰富的遗传多样性，菌株间的遗传相似系数为0.71～0.97.UPGMA聚类分析显示，供试菌株可区分为8个聚类组，菌株的遗传谱系与地理来源无相关性.

关键词：西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）；ISSR-PCR；遗传多样性

[中图分类号]S436.5 [文献标志码]A

Abstract：In order to probe into the relationship between genetic diversity and geographical origin among isolates of Fusarium oxysporum f. sp. nevium from Anhui Province in eastern China， inter-simple sequence repeat-polymerase chain reaction （ISSR-PCR） was conducted to investigate the genetic diversity of 42 isolates of F. oxysporum f. sp. nevium. The result showed that 11 random primers which produced reproducible fragments were screened， generated a total of 129 ISSR fragments， of which 72.9% （94） were polymorphic， revealing high polymorphism among the isolates. Genetic similarity coefficients among all of the isolates ranged from 0.71 to 0.97. Cluster analysis using the unweighted pair-group method with arithmetic averages （UPGMA） indicated that the Anhui isolates were divided into eight groups according to the DNA fingerprints， and that no correlation between ISSR group and geographical origin.

Key words：Fusarium oxysporum f. sp. niveum； ISSR-PCR； genetic diversity； Anhui

西瓜（Citrullus lanatus）原产于非洲，是世界重要的十大水果之一，现已在我国广泛栽培，播种总面积达180.15万公顷，其产值已占蔬菜总产值的10%以上.[1]西瓜在种植过程中易遭受土传真菌枯萎病菌的侵染，给瓜农带来严重的经济损失.1894年，Smith首次报道由尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusarium oxysporum Schl. f.sp. niveum （ E.F. Smith） Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病，该病现广泛分布于非洲、澳大利亚、亚洲、欧洲、北美和南美等国家[2]，是一种世界性毁灭性的土传病害.

尖孢镰刀菌易变异与多型性的特性，是西瓜枯萎病菌专化型分化及生理小种分化的重要原因.研究西瓜枯萎病菌的遗传多样性对于有效控制田间西瓜枯萎病非常必要.目前关于遗传多样性检测技术的报道较多[3]，其中ISSR技术简便可靠、DNA样品用量少、实验成本低、信息量大，已广泛用于动植物和病原真菌遗传多样性的研究.研究表明，ISSR技术比RFLP、SSR和RAPD具有更高的多态性.[4]目前，关于安徽省西瓜枯萎病菌群体遗传多样性未见报道.本研究拟使用ISSR-PCR技术，分析安徽省不同地区西瓜枯萎病菌的遗传结构，探明不同地区西瓜枯萎病菌群体遗传变异特性，探讨指纹图谱与地理来源的相关性，为抗病品种的合理布局和杀菌剂的有效施用提供理論依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2016-2017年，从安徽省六安、凤台、安庆、砀山、肥东等县市采集西瓜枯萎病病株，采用组织分离法分离，经纯化共获得42株西瓜枯萎病菌作为供试菌株.各菌株的采集地、扩增条带数和基因型见表1.

1.2 西瓜枯萎病菌基因组DNA提取

将供试菌株在PDA培养基上培养3 d后，沿菌落边缘用直径为7 mm的打孔器打取菌碟，转移至三角瓶中.三角瓶装PDB培养液100 mL，25 ℃、摇床振荡（100 r/min）培养7 d.用双层灭菌纱布过滤得到菌丝体，使用CTAB 法提取基因组 DNA[5]，置于-20 ℃冰箱中保存备用.

1.3 西瓜枯萎病菌ISSR-PCR分析

1.3.1 ISSR-PCR引物的筛选

从供试菌株中随机选取10个菌株，以其DNA为模板，用40个引物对其进行扩增，筛选出扩增条带清晰、重复性好、多态性高的ISSR引物.引物编号、序列和退火温度见表2.

1.3.2 ISSR-PCR分析

ISSR-PCR 扩增反应采用25 μl反应体系.反应组分包括：12.5 μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，1.0 μL 引物，10 ng 模板DNA，加无菌超纯水至25 μL.PCR 反应参数： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存备用.每个引物均对受试菌株重复扩增3次，每次反应均设不加模板的空白对照.扩增产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳，100 V电泳2～3 h，用0.5 μg·mL-1溴化乙锭溶液染色，紫外灯下观察并用凝胶成像系统照相.

1.4 数据分析

记录电泳结果，参考孙玉友和孙玉刚[3]报道的方法，用NTSYS-pc 2.1软件计算菌株间的遗传相似系数，进行UPGMA聚类分析，构建菌株的亲缘关系树状图.

2 结果与分析

2.1 PCR擴增结果分析

筛选出扩增条带清晰、结果稳定、多态性好的11个引物，对安徽省西瓜枯萎病菌菌株进行ISSR-PCR分析，并确定每个引物的最佳退火温度.扩增结果表明，不同引物扩增的条带数不同，其中引物ILE120扩增的条带最少为8条.引物UBC835扩增的条带数最多，达14条.平均每个引物扩增的条带数为11.6条.多态性条带数94条，占扩增总带数的72.9%.图1为引物ILE131扩增的DNA指纹图谱.

2.2 ISSR聚类分析

采用NTSYS-pc 2.1生物软件对安徽省西瓜枯萎病菌进行UPGMA聚类分析，结果见图2.图2的结果表明，用11个引物扩增的菌株的遗传背景不全相同，42株西瓜枯萎病菌菌株间的遗传相似系数为0.71～0.97.以遗传相似系数0.81为阈值，供试菌株被划分为8个遗传聚类组.其中，居群1分为5个组（A，B，C，E和F），大部分归为A组，占72.7%；居群2分为4个组（A，C，D和G），大部分归为D组，占61.5%；居群3分为4个组（A，B，C和D），大部分归为D组，占68.8%.从聚类图中可以看出，来自相同地区的大部分菌株聚为一类，菌株的聚类与菌株的采集年份无关.来自合肥的3个菌株基因型为E，来自安庆的1个菌株基因型为F，来自于铜陵的1个菌株基因型为G.淮南的8个菌株、合肥的2个菌株、巢湖的2个菌株、安庆的4个菌株、铜陵的1个菌株和阜阳的2个菌株均为基因型A；巢湖的1个菌株、亳州的1个菌株为基因型B；合肥的1个菌株、池州的2个菌株、铜陵的1个菌株、阜阳的1个菌株和亳州的1个菌株均为基因型C；铜陵的8个菌株和亳州的11个菌株为基因型D.因此，来源于一个居群的基因型E，F和G为单源.基因型A和C来源于3个居群，基因型B和D来源于2个居群，表明基因型A，B，C和D为多源的.

3 结论

利用ISSR-PCR技术研究安徽省西瓜枯萎病菌菌株的遗传多样性，共获得129个ISSR条带，其中多态性条带为94个，占72.9%，表明安徽省西瓜枯萎病菌存在较丰富的遗传多样性，菌株间的遗传相似系数为0.71～0.97.UPGMA聚类分析显示，供试菌株可区分为8个聚类组，菌株的遗传谱系与地理来源无相关性.

安徽省西瓜枯萎病菌群体遗传多样性的研究给病害的管理提供了信息，为抗病育种提供了参考.

参考文献

[1] 《中国蔬菜》编辑部. 全国西瓜主要优势产区生产现状（一）[J]. 中国蔬菜， 2011， 1（13）： 5-9.

[2] 刘冬，李萍，毕璋友，等.西瓜枯萎病生物防治技术研究进展[J].信阳农林学院学报，2017，27（3）：82-85.

[3] 孙玉友.利用SRAP分子标记分析栽培稻的遗传多样性[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2012（1）：24-26.

[4] Gilbert JE， Lewis RV， Wilkinson MJ， Caligari PDS. Developing an appropriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm collections[J]. Theor Appl Genet 1999， 98：1125-1131.

[5] Liu D， Coloe S， Baird R， et al. Rapid mini-preparation of fungal DNA for PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology， 2000， 38 （1）： 471.

编辑：琳莉