超声辅助提取对鸡肝蛋白结构及功能特性的影响

王立 张坤 邹烨 张新笑 李鹏鹏 王道营 徐为民

摘要： 以鸡肝为原料，采用NaOH溶剂为提取剂，采用超声辅助法提取鸡肝蛋白，并与常规水浴提取法得到的鸡肝蛋白作比较，通过紫外吸收光谱、荧光光谱、傅里叶红外光谱、扫描电镜研究超声辅助提取对鸡肝蛋白结构的影响，结果表明，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取鸡肝蛋白的得率和总蛋白质含量分别提高了58.1%和9.6%，超声辅助提取导致鸡肝蛋白结构发生伸展，蛋白结构发生改变。与常规水浴提取相比，超声辅助提取可显著提高其凝胶性能，超声辅助提取并没有改变鸡肝蛋白的亚基组成，但超声辅助提取的鸡肝蛋白的溶解度、持水性及吸油性、起泡性及起泡稳定性和乳化性及乳化稳定性均得到显著提高（P<0.05），因此超声辅助提取能显著提高鸡肝蛋白的功能特性，该研究结果为鸡肝蛋白的深加工提供了一定的科学依据和理论基础。

关键词：鸡肝蛋白;超声辅助提取;蛋白质结构;功能特性

鸡肝为雉科动物家鸡的肝脏，占鸡体质量的2.0%～2.5%，是一种营养丰富、附加值较高的肉制品加工副产物之一。鸡肝富含蛋白质、脂肪、糖类，同时还含有钙、铁、磷、铁、锌、硒、VA、VH2等营养元素，其中VA含量远超蛋、奶、肉等食品。鸡肝中硒等微量元素是重要的营养物质，具有增强机体免疫力、抗氧化、抑制肿瘤等重要功能。鸡肝蛋白是一类以共价键连接而成的生物大分子，在生物的新陈代谢中具有重要功能。

超声辅助提取作为一种新型的非热物理加工技术，适用于不同来源的生物活性提取，特别是在蛋白提取等食品领域具有广泛的应用前景，它在促进食品中有效成分的提取具有独特的优势，具有溶剂用量少、蛋白质提取率高等优点。通过超声效应，进一步改变其蛋白质内部分子结构，如维持蛋白质结构的化学键——氢键、范德华力、疏水性等，从而改变其溶解性、持水性、持油性、乳化性、起泡性等功能特性，虽然鸡肝含优质完全蛋白质，但到目前为止，对鸡肝进行深加工提取鸡肝分离蛋白质，进一步研究鸡肝蛋白的结构特征及功能特性的研究报道较少。因此，本研究采用超声辅助碱法提取鸡肝蛋白，进一步研究其结构特征和功能特性，为充分利用肉制品加工副产物鸡肝蛋白在食品等领域的潜在价值提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：鸡肝蛋白为实验室自制，试剂：凝固酶、Marker标品由上海源叶生物科技有限公司生产，考马斯亮蓝由南京建成生物科技有限公司生产，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-6100型紫外分光光度计购自上海美普达仪器有限公司，FL-4600荧光分光光度计购自日本日立高新技术公司，Zeta电位分析仪购自上海麦克默瑞提克仪器有限公司，傅里叶变换红外光谱仪购自天津港东科技发展股份有限公司，EVO-LS10扫描电子显微镜购自德国蔡司股份有限公司，Uncen MR台式冷冻离心机购自英国Hero lab公司，M124A电子天平购自意大利BEL公司，便携式pH计购自美国OUAUS公司，HJ-8（DF-1）集热式磁力搅拌器购自常州国华电器有限公司，高速均质机购自德国IKA公司，AR2000流变仪购自英国TA公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鸡肝蛋白的提取工艺 常规水浴提取：新鲜鸭肝（10g）一匀浆（10000 r/min，30s）一异丙醇脱脂（10%，静置12h）一离心（5000g，15min）一干燥一水浴提取[时间：40 min，温度：40℃，料液比1∶60（体积比），NaOH l%]一离心（5000g，15min）一取上清液一测定常规水浴提取鸡肝蛋白含量（考马斯亮蓝法）一透析一真空冷冻干燥。

超声辅助水浴提取：新鲜鸡肝（2g）一匀浆（10000 r/min，30s）一异丙醇脱脂（10%，静置12h）一离心（5000g，15min）一干燥一超声辅助水浴提取[超声功率：150 W，超声时间：40 min，温度：40oC，料液比1∶60（体积比），NaOH l%]一离心（5000g，15min）一取上清液一测定超声辅助提取鸡肝蛋白含量（考马斯亮蓝法）一透析一真空冷冻干燥。

1.3.2 鸡肝蛋白提取率的测定 鸡肝蛋白得率=所提鸡肝蛋白总量/原料中粗蛋白总量×100%

1.3.3 鸡肝蛋白的结构测定

1.3.3.1 鸡肝蛋白的紫外可见分光光谱测定使用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液配制1.0 mg/ml常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白溶液，在25℃下使用紫外可见分光光度计在波长200～700 nm对2种蛋白溶液进行分析测定。紫外分光光度计扫描条件：石英比色皿1cm，扫描速度10 nm/min，步长lnm。0.01%的磷酸盐缓冲液的光谱作为空白光谱，鸡肝蛋白溶液的光谱与磷酸盐缓冲液光谱的差谱即为鸡肝蛋白的紫外光谱。

1.3.3.2 鸡肝蛋白的荧光光谱测定 使用10mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0）制备0.2 mg/ml常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白溶液。在25℃下使用荧光分光光度计对2种溶液进行分析。使用光程为lcm的石英比色皿。激发波长为280nm，发射光谱范围为300～ 460 nm。激发和发射狭缝宽度为2.5 nm，扫描速度为1200 nm/min。

1.3.3.3 鸡肝蛋白的凝胶电泳测定（SDS-PAGE）制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，将常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白上清液与上样缓冲液进行混合，沸水浴10min，于12000 g离心3 min。取15μl的上清液上样。采用分子量蛋白Marker（10—180000）作为对照，加入1L的电泳缓冲液，在电泳电流为16mA下进行15min后再在32mA下进行th。电泳结束后，采用考马斯亮蓝R-250染色15min，通過脱色液进行脱色，直至可以清楚辨别条带为止。

1.3.3.4 鸡肝蛋白的傅里叶红外光谱测定 使用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制0.2mg/ml常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白溶液。在25℃下使用傅里叶红外光谱仪在波数525—4000cm-1内对2种蛋白溶液进行扫描。扫描条件：加样量0.5ml，分辨率4cm-l，扫描次数7209，磷酸盐缓冲液红外光谱作为空白，蛋白溶液与空白光谱的差值即为鸡肝蛋白溶液的红外光谱图。

1.3.3.5 鸡肝蛋白的流变特性测定 采用AR2000流变仪，选择直径40 mm.不锈钢平板测量系统，平板间距lnm，温度25℃，剪切速率20～200s-1，记录其剪切黏度及剪切应力的变化情况。

将凝固酶添加到常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白溶液中以实现凝胶化。在加入凝固酶之前，先加入0.02% CaCl，。在30 ℃下加入凝固酶凝胶后，将凝胶样品（20ml）置于同心圆筒中。于流变仪中记录样品的储能模量（G）和损耗模量（G”），并将储能模量数据用于凝胶化评估，试验平行做3次。

1.3.3.6 鸡肝蛋白的扫描电镜观察 将常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白采用液氮吹干，采用扫描电镜（SEM）观察其蛋白表面微观结构。扫描电镜条件：加速电压10 kV。

1.3.4 鸡肝蛋白的功能特性测定

1.3.4.1 鸡肝蛋白的溶解性测定为了测定其溶解度，将10mg样品溶于8ml蒸馏水中，并用lmol/LHC1或lmol/L NaOH调节pH分别至2、4、6、8、10和12，并将混合物于室温下搅拌30 min。在5 000 g离心15min，通过蒸馏水将溶液体积预先调节至与样品溶液相同的pH。采用考马斯亮蓝法测定其上清液中的蛋白质含量。蛋白质溶解度计算如公式为：溶解度=上清液蛋白质含量/总蛋白质含量×100%。

1.3.4.2 鸡肝蛋白的持水性测定称取100mg常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白于10ml离心管中，加入5ml去离子水充分混匀，于室温下静置1h，5000g离心10min.去除上清液，将离心管倒置于滤纸上以去除多余水分，准确称取沉淀质量。以每克样品吸附水的质量数表示持水性。持水性计算公式为：持水性=（沉淀物总质量一样品质量）/样品质量×100%。

1.3.4.3 鸡肝蛋白的吸油性测定称取100 mg常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白于10 ml离心管中，加入5ml色拉油并充分混匀，于室温下静置1h，5000g离心10 min，去除上层未吸附的色拉油后准确称质量，以每lg蛋白质样品吸附油的质量数表示吸油性（OHC）。吸油性计算公式为：吸油性=（沉淀物质量一样品质量）/样品质量×100%。

1.3.4.4 鸡肝蛋白的起泡性及起泡稳定性的测定制备0.1%、0.5%、1.0%及2.0%的20ml常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白溶液至100ml量筒内，测定此时溶液的体积（vo）。然后将溶液在高速均质机下以12000g均质30 s后立即转移到量筒内，测量此时量筒内的样品体积（VT），静置60min测量此时量筒内的样品体积（Vt）。起泡性（FC）和起泡稳定性（FS）计算公式分别为：起泡性=VT/VOxl00%;起泡稳定性=Vt/Voxl00%。式中：VT是均质后的总体积;v0是均质前的原始体积;vt是在室温下静置60mm后的总体积。

1.3.4.5 鸡肝蛋白的乳化性及乳化稳定性的测定通过分光光度法测定常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白的乳化性，采用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液配制鸡肝蛋白溶液的质量比为0.15，加人大豆油，混合液总体积为40 ml。采用高速均质机将混合液于10000 g下均质l min，乳状液待用。取底部乳状液50μl，用0.1%十二烷基硫酸钠溶液将鸡肝蛋白稀释至100倍置于比色皿中，以十二烷基硫酸钠溶液作为空白，于500 nm處测定吸光度Ao，10min后，测吸光度A10，乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI计算公式分别为：稀释倍数;

式中：Ao为0 min时测定的吸光度;A10为10 min时测定的吸光度;C为鸡肝蛋白的质量浓度;β为大豆油的质量比（0.15）。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 16.0统计软件进行处理，结果以平均值±标准差表示，Turkey检验用于两组间的数据分析，P<0.05表示两组之间具有显著性差异，采用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 鸡肝蛋白提取率

由表1可知，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白的得率和总蛋白质含量分别提高了58.1%、9.6%，这可能是由于超声提取导致鸡肝蛋白细胞壁破裂，加快了溶剂的渗透效率，从而提高了蛋白质提取率。Zou等采用超声辅助提取鸭肝蛋白，得率和总蛋白质含量分别提高了67.7%、4.6%，表明采用超声提取可显著提高蛋白质提取率和总蛋白质含量。

2.2 鸡肝蛋白结构

2.2.1 鸡肝蛋白的紫外可见光谱蛋白质的近紫外吸收光谱（250—350 nm）与它的芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸等）密切相关，波长250—350 nm处的紫外吸收光谱图可提供蛋白质分子在溶液中的构象变化。由图1可知，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，采用超声辅助提取的鸡肝蛋白，紫外吸收光谱发生明显位移变化，并且吸收强度具有不同程度的增加趋势。在波长285nm处，常规水浴提取和超声辅助提取的鸡肝蛋白具有明显的特征吸收峰，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白紫外吸收强度显著增大，这可能是由于超声处理后导致其分子内部的疏水性基团暴，使其不饱和基团增加，这与金建采用双频超声预处理玉米醇溶蛋白的结果是一致的，表明超声提取改变了鸡肝蛋白的内部结构，使其紫外吸收强度明显提高。

2.2.2 鸡肝蛋白的荧光光谱 荧光光谱是表征蛋白质分子构想发生变化的另一手段，通过测定蛋白质中部分能产生荧光的氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）残基来推测其蛋白质构想的变化趋势。由图2可知，在波长330～340 nm处，常规水浴提取的鸡肝蛋白和超声辅助提取的鸡肝蛋白的荧光强度最高。与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，采用超声辅助提取的鸡肝蛋白荧光强度显著提高，这可能是由于经超声处理后，鸡肝蛋白内部结构发生伸展，破坏了其分子间作用力，导致部分色氨酸残基暴露，从而提高了其荧光强度。任晓锋通过双频超声预处理玉米醇溶蛋白后其荧光强度明显提高。表明采用超声辅助提取导致鸡肝蛋白二级结构发生变化，这可能与超声处理时产生的剪切力有关。

2.2.3 鸡肝蛋白的凝胶电泳 由图3可知，常规水浴提取的鸡肝蛋白和超声辅助提取的鸡肝蛋白的所有条带是完整的，没有出现额外碎条带，这与Zhang等研究采用超声处理后花生蛋白凝胶电泳没有发生变化是一致的，说明超声辅助提取并没有改变鸡肝蛋白的亚基组成。

2.2.4 鸡肝蛋白的傅里叶红外光谱 蛋白质的肽键是一种酰胺键，它在红外区有特征吸收峰，其中酰胺I带对蛋白质结构分析最为重要，它与蛋白质二级结构具有一定的对应关系，酰胺I带具有一个最大吸收峰（波数为l648 cm-1），该峰对蛋白质二级结构变化最为敏感，因此可通过红外光谱对鸡肝蛋白二级结构进行分析。由图4可知，常规水浴提取的鸡肝蛋白和超声辅助提取的鸡肝蛋白在波数为1500-1700cm-1具有相同特征的最大吸收峰，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白的二级结构变化更为显著，这与任晓锋采用双频超声处理玉米醇溶蛋白其波数在1648cm-l具有相同特征最大吸收峰是一致的，表明采用超声处理对鸡肝蛋白的二级结构产生了重要影响。

2.2.5 鸡肝蛋白的流变特性 流变性能与蛋白质的功能性质密切相关，如：凝胶能力、起泡能力影响着食品的品质。由图SA可知，鸡肝蛋白呈现假塑形流体（n<1），即黏度随剪切速率的增大而减小。在20～200 s-1的高剪切速率下，与常规水浴提取相比，超声提取能显著增加鸡肝蛋白的流变指数n值，这与胡昊采用高场强超声波处理大豆蛋白的流变性变化是一致的，这可能是由于超声波的空穴作用加速鸡肝蛋白分子运动使其结构发生变化，从而导致其流变性能发生改变。由图SB可知，常规水浴提取的鸡肝蛋白和超声辅助提取的鸡肝蛋白的储能模量G随温度的升高而增大。与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白具有更高的弹性，这可能是由于超声处理能促使鸡肝蛋白形成均一、致密、高强度的凝胶网络结构。

2.2.6 鸡肝蛋白的表面微观结构 由图6可知，与常规水浴提取的鸡肝蛋白致密的网状结构相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白出现很多微孔，结构变得疏松。这些微观结构的变化可能是由于超声的空化效应使其形成的局部微射流及震荡波所产生的剪切力破坏了鸡肝蛋白分子间氢键和范德华力，从而使更多的巯基和疏水性基团暴露于其蛋白质表面，导致其粒径减小，蛋白质结构遭到破坏，使得蛋白质聚集体发生分散，形成更加宽松的层状结构，这与金建采用双频超声处理玉米醇溶蛋白后表面微观结构变得疏松是一致的，采用超声处理对鸡肝蛋白结构产生重要影响，导致其表面微观结构发生显著变化。

2.3 鸡肝蛋白的功能特性

2.3.1 鸡肝蛋白的溶解性 溶解度是衡量蛋白质变性和聚集的重要指标之一，是蛋白质的重要功能性质之一。与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白溶解度显著提高（图7）。这是由于超声处理引起蛋白质结构改变，形成可溶性蛋白质聚集物，蛋白质粒径减小，从而增加了蛋白质与水的相互作用。于雷等采用超声波辅助酶法提高了提取的米糠蛋白的溶解度。鸡肝蛋白的溶解度在等电点时（pH为4）时，溶解度最低，与其他pH組有显著差异（P<0.05），这主要是由于鸡肝蛋白在等电点时呈中性，缺乏分子间静电排斥力，导致鸡肝蛋白沉淀，从而降低了其蛋白溶解度。当pH值偏离等电点，溶解度增大，pH值大于7时的溶解度高于pH值小于7时的溶解度。

2.3.2 鸡肝蛋白的持水性及吸油性蛋白质持水性是焙烤食品、肉制品等食品加工体系中的重要特性和功能指标。吸油性可增强食品对脂肪的吸附能力，从而改变其口感及风味。从表2可知，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白的持水性及吸油性分别提高了37.9%、29.5%（P

2.3.3 鸡肝蛋白的起泡性及起泡稳定性蛋白质起泡性在食品工业中具有重要作用，在饮料、咖啡等有着广泛应用。由表2可知，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白起泡性及起泡稳定性分别提高了51.5%、75.9%（P<0.05），可能是由于超声处理的机械效应和空化作用改变了鸡肝蛋白结构，更多的疏水性基团和亲水性基团暴露，具有更大的表面活性，从而降低水的表面张力，这与刘国琴等采用超声提取的大豆分离蛋白的起泡性显著增加是一致的，表明超声提取具有提高鸡肝蛋白起泡性及起泡稳定性的作用。

2.3.4 鸡肝蛋白的乳化性及乳化稳定性 蛋白质乳化性及乳化稳定性在蛋糕、饮料等食品工业中具有重要作用。由表2可知，与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白的乳化性及乳化稳定性分析提高了45.5%和37.0%（P<0.05）。这可能是由于通过超声处理导致鸡肝蛋白内部结构遭到破坏，其结构更加松散，使得疏水性基团具有亲水亲油性，使其乳化性能提高，这与罗娟采用超声提取的豆粕蛋白，在一定的超声功率下其乳化性及乳化稳定性显著提高一致，表明超声处理提高了鸡肝蛋白的乳化性及乳化稳定性。

3 结论

与常规水浴提取的鸡肝蛋白相比，超声辅助提取的鸡肝蛋白的得率和总蛋白质含量均显著提高（P<0.05），表明超声辅助法可提高鸡肝的利用率。

超声辅助提取可导致鸡肝蛋白的分子结构伸展，使其蛋白高级结构发生改变，但超声作用并没有改变鸡肝蛋白的一级结构。同时，超声辅助法可显著提高鸡肝蛋白的凝胶性能等作用，扩大了鸡肝蛋白的潜在应用范围。

与常规水浴提取相比，采用超声提取可显著提高鸡肝蛋白的功能特性，该研究结果可为鸡肝蛋白的精深加工及高值化利用提供理论基础。