RP—HPLC法同时测定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β β—二甲基丙烯酰紫草素的含量

孙健文 温宪春 蔡德富 王玥 吴永会

中图分类号 R284.1；R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）04-0455-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.06

摘 要 目的：建立同時测定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱为Kromasil 100-5 C18，流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液（80 ∶ 20，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为516 nm，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。结果：紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素检测质量浓度线性范围分别为0.404～10.100 μg/mL（r=0.999 8）、5.350～107.000 μg/mL（r=0.999 6）、2.035～40.700 μg/mL（r=0.999 8）；定量限分别为0.40、2.91、1.34 μg/mL，检测限分别为0.12、0.87、0.40 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD<2.0%（n=6）；加样回收率分别为99.12%～104.18%（RSD=1.85%，n=6）、96.51%～100.21%（RSD=1.43%，n=6）、98.11%～102.51%（RSD=1.42%，n=6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量的同时测定。

关键词 紫草；紫草素；乙酰紫草素；β，β-二甲基丙烯酰紫草素；反相高效液相色谱法；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of shikonin， acetylshikonin and β，β-dimethylacrylshikonin in Arnebia euchroma. METHODS： RP-HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil 100-5 C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid solution（80 ∶ 20，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 516 nm， column temperature was 25 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of shikonin， acetylshikonin and β，β-dimethylacrylshikonin were 0.404-10.100 μg/mL（r=0.999 8）， 5.350-107.000 μg/mL（r=0.999 6）， 2.035-40.700 μg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limit of quantitation was 0.40，2.91，1.34 μg/mL， and the limit of detection was 0.12，0.87，0.40 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. The recovery rate were 99.12%-104.18%（RSD=1.85%，n=6），96.51%-100.21%（RSD=1.43%，n=6）， 98.11%-102.51% （RSD=1.42%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible. It can be used for simultaneous determination of shikonin， acetylshikonin and β，β-dimethylacrylshikonin in A. euchroma.

KEYWORDS Arnebia euchroma； Shikonin； Acetylshikonin； β，β-dimethylacrylshikonin； RP-HPLC；Content

紫草（Arnebia euchroma）为我国传统常见中药，也是新疆特色药材[1]，其作为药用最初载于《神农本草经》，列为中品，多用于麻疹不透、湿疹、水火烫伤等症[2]，临床上常用于治疗静脉炎、烧烫伤、皮肤病和慢性肾炎等[3]。现代研究表明，紫草药材中的主要活性成分为羟基萘醌色素类成分，其中的紫草素及其衍生物具有抗癌、抗炎、降血糖、提高免疫力等多种作用[4-5]。紫草药材不仅被广泛应用于临床，同时在食品、化妆品、印染工业中也得到广泛应用[6]。

目前，治疗癌症的主要措施仍为化疗，但化疗的副作用较大，严重影响患者的生存质量。因此，寻找高效、副作用小的治疗方法刻不容缓[7]。紫草药材由于其具有良好的抗癌作用，且作用机制涉及多个靶点[8-10]，广受关注。2015年版《中国药典》（一部）仅以紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素为指标成分进行紫草药材及饮片的质量控制，缺乏质量评价的科学性和全面性[11-12]。

本试验采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对紫草药材中3种萘醌类成分紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素的含量进行了同时测定，旨在建立一种简单、快速的紫草药材中多种色素成分的定量方法，以期为其质量控制提供快速、有效的检测方法。

1 材料

1.1 仪器

600 Controller型HPLC仪，包括2487型紫外检测器、Empower 3色谱数据软件（美国Waters公司）； KQ-50DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AE240型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试剂

紫草素对照品（批号：B21682，纯度：≥98.0%）、乙酰紫草素对照品（批号：B21508，纯度：≥98.0%）、β，β-二甲基丙烯酰紫草素对照品（批号：B24012， 纯度：≥98.0%）均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯；水为去离子水。

1.3 药材

紫草药材购于新疆当地药店（批号：50100310、20140801、20161001），经齐齐哈尔医学院郭丽娜教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液（80 ∶ 20，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：516 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取待测成分对照品各适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得单一对照品贮备液；精密量取上述单一对照品贮备液各适量，加甲醇制成紫草素、乙醇紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素质量浓度分别为4.04、42.80、32.56 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取药材样品粉末（过2号筛）0.2 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，超声（功率：150 W，频率：40 kHz）提取45 min，室温下放置，加甲醇定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液1 mL，加甲醇定容至5 mL，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 以甲醇作为阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，理论板数以紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素峰计均>8 000；分离度>1.5，各成分基线分离良好，详见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下单一对照品贮备液各适量，分别置于10 mL量瓶中，加流动相定容，制成紫草素质量浓度为0.404、0.808、1.616、3.232、10.100 μg/mL，乙酰紫草素质量浓度为5.350、10.700、17.120、21.400、107.000 μg/mL，β，β-二甲基丙烯酰紫草素质量浓度为2.035、4.070、8.140、16.280、40.700 μg/mL的系列单一对照品溶液。精密量取上述系列单一对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性范围见表1。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下单一对照品贮备液各适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限；当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限。结果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素的定量限分别为0.40、2.91、1.34 μg/mL，检测限分别为0.12、0.87、0.40 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下单一对照品贮备液各适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素峰面积的RSD分别为0.96%、1.31%、0.64% （n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：50100310）适量，分别于室温下放置0、4、8、12、24、48 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素峰面积的RSD分别为0.59%、0.81%、0.72%（n=6），表明供试品溶液室温放置48 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取药材样品（批号：50100310）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算药材样品含量。结果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量平均值分别为0.456、8.587、5.175 mg/g，RSD分别为1.42%、0.38%、0.74%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量药材样品（批号：50100310）6份，每份0.1 g，分别加入一定量的待测成分对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.10 药材样品含量测定

取3批药材样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液各3份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3。

3 讨论

目前，新疆紫草还不能有效地进行人工种植，但国内乃至国际市场需求量却在日益增加，野生新疆紫草遭到掠夺性采摘，因此有效合理地利用紫草药材中的有效成分非常重要；同时，研究紫草药材中有效成分的相关作用也成为热点课题[2]。

预试验考察流动相时，笔者曾尝试乙腈-水（75 ∶ 25，V/V），结果发现待测成分峰峰形不好，后改用乙腈-0.1%甲酸溶液（80 ∶ 20，V/V），结果待测成分峰峰形良好，且保留时间稳定。因此，最终将流动相确定为后者。根据2015年版《中国药典》（一部），紫草药材中总萘醌吸收波长为516 nm[12]，故本研究以此作检测波长。

由含量测定结果可知，3批药材样品中乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量变化较大，其原因可能为紫草药材尚不能人工种植，而野生品种的生长区域、产收时间不同导致其成分含量变化大[3]。各批次紫草藥材中乙酰紫草素含量均为最高，说明紫草萘醌色素类化合物中乙酰紫草素为主要成分，该论据为本课题组进一步研究乙酰紫草素抗肿瘤作用提供了帮助。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量的同时测定。

参考文献

[ 1 ] 毛艳，张瑞萍，贺金华，等. 紫草中萘醌类化学成分的快速高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术分析[J]. 中国药房，2014，25（43）：4090-4092.

[ 2 ] 袁慧勤，胡迪. 紫草的药理作用及单味药临床外用概述[J]. 医学综述，2015，21（3）：504-506.

[ 3 ] 董薇薇，张建民.紫草的临床应用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（24）：368-371.

[ 4 ] 詹志来，胡峻，刘谈，等. 紫草化学成分与药理活性研究进展[J]. 中国中药杂志，2015，40（21）：4127-4135.

[ 5 ] 杨海红，杨雪梅，杨春霞，等. 紫草蒽醌类成分的提取及其复合物栓的抗炎活性研究[J]. 中国民族民间医药，2012，21（17）：54-56.

[ 6 ] 马莹. 药用紫草的研究进展[J]. 黑龙江医药，2013，26（1）：131-132.

[ 7 ] 崔晓秋. 中药紫草化学成分及药理作用最新研究进展[J]. 济宁医学院学报，2015，38（5）：356-358、362.

[ 8 ] CHEN C， SHANMUGASUNDARAM K， RIGBY AC，et al. Shikonin， a natural product from the root of Lithospermum erythrorhizon， is a cytotoxic DNA-binding agent[J]. Eur J Pharm Sci， 2013， 49（1）：18-26.

[ 9 ] 李亮，陈钰沁，张超，等. 紫草素的研究进展[J]. 云南中医学院学报，2011，34（5）：62-66.

[10] 朱梦媛，王汝冰，周文，等. 紫草素及其衍生物抗肿瘤作用研究进展[J]. 药学学报，2012，47（5）：588-593.

[11] 郝鹤，李鹏跃，叶和春，等. 新疆紫草7种萘醌类成分的同时测定[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（18）：108- 112.

[12] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[S]. 2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：340-341.

（收稿日期：2017-04-20 修回日期：2017-06-06）

（编辑：张 静）